专利名称：器官玻璃化冷冻保存液的制作方法
技术领域：
肾脏是人体中机能复杂的器官，在4°C灌注条件下只能离体保存最多50小时。要长期甚至永久保存肾脏，必须进一步降低保存温度，抑制组织细胞的代谢率，甚至使细胞代谢完全停止。肾脏如能在合适的冷冻条件下长期保存，在需要时将冷冻保存的供肾采用合适的手段“复苏”后再移植，将为临床移植工作开辟一个崭新的前景。冷冻保存方法被认为是实现器官长期保存的理想途径，问题的关键是器官体积较大，在降温和复温过程中很难克服细胞内外冰晶形成，同时不能避免机械、化学、 渗透压以及生物学方面的损伤，所以至今较大体积器官的冻存问题仍未解决。玻璃化 (Vitrification)是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程。玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显区别，在降温冷冻过程中不形成冰晶，因而是一种理想的冷冻保存途径。
背景技术：
近期以来，冷冻保存细胞、精子、胚胎甚至卵巢组织已先后取得成功，但是复杂器官如肾脏的冷冻保存，却依然是个尚未突破的难题。当今世界，随着肾脏移植技术的迅速发展和肾病患者数量的不断增加，迫切需要大量的肾脏贮备和供应。目前临床移植用供肾均在0°C以上保存，此方法虽然比较成熟、简便，但保存时间十分有限。虽然国内外学者从改进保存液水平及保存工具等方而着手延长肾脏保存时间，或在有限的保存时间内完善组织配型工作，以提高供肾的合理使用率和移植后的长期存活率，但仍不能满足临床需求。此外， 在国内供体器官缺少的情况下，由于配型、病人条件不符和地域等原因也会造成一定的器官资源浪费。能否在一个国家乃至整个世界范围内共享人白细胞抗原(HLA)配型吻合的肾脏，使每一个受者都能及时得到最优化的供肾？对于这样理想化的愿望，只有通过改进肾脏保存技术，延长供肾保存时间至数月甚至数年，并建立“器官库”(Organ Bank)才能最终实现。
发明内容
本发明所述器官玻璃化冷冻保存液，由二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份组成，二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖浓度均为 0. l-6mol/L，聚乙二醇浓度为l-20mmol/L，PH值范围为5. 0-8. 0。玻璃化冷冻保存液在降温冷冻过程中溶液呈玻璃态，不形成冰晶，避免或减少细胞的冰冻损害，可保护细胞结构和形态的完整性，同时完全抑制组织细胞的能量代谢。经合适的手段复苏后细胞代谢活动得到恢复，可重新发挥生物学功能。本发明所述器官玻璃化冷冻保存液，可用于肾脏的冷冻保存(-200--30°C)，也可应用于其他器官(肝脏、心脏等)的长期冷冻保存。
具体实施例方式将经本发明所述器官玻璃化冷冻保存液灌注肾脏，降温至_80°C，转入深低温冰箱或液氮长期保存。器官复苏时升温至4°C，洗脱保存液后进行相关形态学和功能学检查。
通过本发明所述器官玻璃化冷冻保存液在-80°C保存2周的新西兰大白兔肾脏， 大体形态未见明显冰冻损害，皮髓质结构清晰，光学显微镜下肾小球内毛细血管襻完整，肾小管上皮细胞轻微肿胀，电子显微镜下肾小球滤过膜、足细胞和系膜细胞等超微结构清晰， 细胞核染色质浓密，胞质内细胞器数目正常，上皮细胞腔面刷状缘微绒毛排列整齐，血管内皮细胞及弹性膜完整，显示肾脏经冷冻保存后组织形态未见明显破坏。通过本发明所述器官玻璃化冷冻保存液在-80°C保存2周的新西兰大白兔肾脏， 离体灌注后进行酚红排泌试验(PSP试验)、靛胭脂实验测定肾小管功能，PSP15分钟和120 分钟排泌量，均接近正常值(25% ；55% )，靛胭脂灌注后即刻见到蓝色尿液排出，显示肾脏经冷冻保存后肾小管具有排泌功能。通过本发明所述器官玻璃化冷冻保存液在-80°C保存2周的比格犬肾脏，自体肾移植术后1个月进行彩色多普勒超声、发射单光子计算机断层扫描(ECT)和静脉分泌造影 (IVP)等检查，彩超可见移植肾脏内血流通过，IVP和ECT显示肾脏分泌/滤过功能持续存在。
权利要求
1.一种器官玻璃化冷冻保存液，其特征在于，包含二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、 丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖浓度均为0. l-6mol/L，聚乙二醇浓度为l-20mmol/L，PH值范围为5. 0-8. 0。
3.根据利权要求1所述的保存液，其特征在于，保存温度为-200-30摄氏度。
4.根据权利要求1至3任一所述的保存液，其特征在于所述的器官为肾脏、肝脏、心脏、 肺脏、皮肤或者肢体等。
5.一种器官保存方法，包括将器官放入保存液中，其特征在于，所述保存液中包含二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份。
6.根据权利要求5所述的保存方法，其特征在于，将器官进行玻璃化冷冻保存。
全文摘要
本发明涉及医学器官保存领域，具体公开了用于器官长期保存的玻璃化冷冻保存液，其特征在于该保存液由二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份组成，二甲基亚砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖浓度均为0.1-6mo/L，聚乙二醇浓度为1-20mmol/L，pH值范围为5.0-8.0。实施按照本发明提供的用于器官保存的玻璃化保存液，在降温冷冻过程中呈玻璃态不形成冰晶，保护组织形态和结构完整性，在冷冻条件下完全抑制组织细胞的能量代谢，复苏后恢复其生物学功能，可用于肾脏的冷冻保存，也可进一步推广应用于其他器官的长期冷冻保存，供科研和临床应用。
文档编号A01N1/00GK102550541SQ201010601358
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者刘迪, 潘峰 申请人:刘迪, 潘峰