专利名称：大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法
技术领域：
本发明涉及的是一种低温保存技术领域的方法，具体是一种大苞鞘石斛原球茎玻 璃化超低温保存方法。
背景技术：
大苞鞘石斛(Dendrobium wardianum Warner)，花大、色艳，花期长，是石斛属中观 赏价值很高的种类；另外，新鲜或干燥茎可入药，有益胃生津、滋阴清热的功效。作为我国兰 科第2大属的野生种类，国家II级保护植物，大苞鞘石斛对生态环境要求严格，在极为狭窄 的分布区域内，仅见于我国云南东南部至西部海拔1350 1900m热带雨林中，缅甸、泰国和 印度东北部也有分布。由于石斛属植物生长缓慢，种子极其微小，且胚具有生理后熟现象， 自然条件下繁殖率极低(种子萌发率低于5%)；加之长期非法采挖，致使多种石斛原生种 已濒临灭绝。但到目前为止，大苞鞘石斛种质资源保存仍采用传统的原地保存和异地保存， 这2种保存方法因受保存地自然环境的影响，无法确保长期稳定地保存种质资源。玻璃化法超低温保存(Vitrification-Cryopreservation)种质资源是上世纪70 年代发展起来的唯一不需要连续继代的中长期保存方式，即将受高浓度冷冻保护剂作用 后的细胞或组织，连同冷冻保护剂一起在快速降温过程中形成非结晶的玻璃化状态。该方 法具有简便、成本低、保存材料遗传性稳定等优点，对一些珍稀濒危植物种质资源的保存具 有重要的意义，现已应用于兰科植物鹤顶兰(Phaius tankervilleae (Bank ex L’ Herit.) Bi.)种子，白芨(Bletilla striata Maxim.)合子胚，大花蕙兰‘幻影，(Cymbidium grandiflorum Sw. iIdol')莲尖、原球莲，香荚兰(Vanilla fragrans (Salisb.) Ames ‘Andrews，)茎尖，血红石斛(Dendrobium cruentum Rchb. f.)原球茎，以及铁皮石斛 (Dendrobium officinale Kimuraet Migo)种子、原球茎和原生质体，但大苞鞘石斛超低温 保存技术尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温 保存方法，为濒危的大苞鞘石斛种质资源保存提供了技术保证，将对石斛属植物甚至兰科 植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温冷冻方法，通过将原球茎低 温-高渗预处理后，转至装载液中并经脱水处理后转入装有玻璃化溶液的冷冻管中，并迅 速投入液氮进行超低温保存。所述的原球茎是指取继代培养60d，直径约为2 3mm的大苞鞘石斛原球茎；所述的低温-高渗预处理是指将原球茎在含有0. Smol · L-1蔗糖的1/2MS (大量 元素减半的MS培养基)培养基上4°C环境下培养6d ；所述的装载液的组分为l/2MS、2mol · L—1甘油和0. 4mol · L—1蔗糖。
所述的脱水处理是指将装载处理的原球茎在0°C下转到玻璃化溶液中脱水 40mino所述的玻璃化溶液的组分及体积比为1/2MS、30%甘油、15%乙二醇、15%二甲基 亚砜以及0. 4mol · L—1蔗糖。本发明涉及上述超低温保存的解冻方法，通过将装有原球茎的冷冻管从液氮中取 出，置于40°C水浴中快速解冻lmin，然后用培养液洗涤后用无菌滤纸吸干表面溶液后转入 恢复培养基中进行恢复培养得以实现。所述的用培养液洗涤是指用含有1. 2mol · L—1蔗糖的1/2MS培养液洗涤3次，每 次间隔lOmin。所述的恢复培养基的组分及重量比为1/2MS、6_BA0. 2mg -Γ1 (6_苄氨基腺嘌呤)、 NAAO. Smg·!/1 (萘乙酸)和2%蔗糖。所述的恢复培养是指在恢复培养 基中先在黑暗环境下培养14d，然后转入光照 强度为13081x(正常光强一半)弱光环境下培养7d，光照时间为16h 'cT1,再置于光照强度 为23361x环境下培养30d，光照时间为16h · cf1。在液氮中保存时间的长短对原球茎存活率没有影响，因此，可以实现大苞鞘石斛 原球茎长期保存的目的。
图1为实施例效果示意图；其中左图为恢复培养30d原球茎；右图为恢复培养90d原球茎增殖状态。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1保存前原球茎的选取状态在1/2MS、6-BA0. 2mg · L—^NAAO. 5mg ·蔗糖培养 基上增殖60d，剥离后单个原球茎直径约2 3mm。如图1所示，为大苞鞘石斛原球茎按照上述步骤进行玻璃化超低温保存后，经恢 复培养30d后变绿呈现活力状态(左图)，90d后原球茎开始出现细胞增殖(右图)。实施例2选择蔗糖、山梨醇、甘露醇和葡萄糖4种渗透压调节剂，浓度分别为0.2、0. 4、 0. 6,0. Smol · L—1，室温条件下预处理8d后，经装载液和PVS2脱水后TTC法测定得出含 0. 8mol · Γ1蔗糖预处理后存活率最高，达到43. 5%。室温-高渗(25 0C，0. 8mol · L-1蔗糖)和低温-高渗(4°C，0. 8mol · L-1蔗糖)预 处理4、6和8d后，经装载液和PVS2脱水后得出低温-高渗处理6d可以达到较高的存活率， 为 46. 6%。实施例3原球茎经低温-高渗预处理后，在O °C条件下用4种玻璃化溶液PVSl (1/2MS、22%甘油、15%聚乙二醇、15%乙二醇、7% 二甲基亚砜和0. 5mol · Γ1山梨醇)、PVS2、 PVS4(1/2MS、35 % 甘油、20 % 乙 二醇和 0. 6mol · Γ1 蔴糖)、PVSW(1/2MS、10 % 脯氨酸禾口 0. 6mol · Γ1蔗糖)处理和装载液装载脱水后40min，筛选出最佳的玻璃化溶液是PVS2。实施例4 解冻洗涤后的原球茎转入恢复培养基1/2MS、6-BA0. 2mg ·Γ\ΝΑΑ0. 5mg -L"1和2% 蔗糖中，按照3种恢复培养方式进行(1)黑暗培养30d;(2)黑暗中培养14d后，原球茎直 接转入正常光(光照强度为23361x)下，光照时间为leh.cT1 ;(3)黑暗中培养14d后，先转 入弱光下(光照强度为13081x)培养7d，再置于正常光下培养，光照时间均为16h · Cf1 ；待 恢复培养30d后统计存活率，第3种方法可使大苞鞘石斛原球茎超低温保存后实际存活率 达到20. 0%，而前2种方法未见有成活的原球茎。
权利要求
1.一种大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，其特征在于，通过将原球茎低 温-高渗预处理后，转至装载液中并经脱水处理后转入装有玻璃化溶液的冷冻管中，并迅 速投入液氮进行超低温保存。
2.根据权利要求1所述的大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，其特征是，所述 的原球茎是指经取继代培养60d，直径约为2 3mm的大苞鞘石斛原球茎。
3.根据权利要求1所述的大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，其特征是，所述 的低温-高渗预处理是指将原球茎采用含有1/2MS以及0. Smol 蔗糖培养基上4°C环 境下培养6d。
4.根据权利要求1所述的大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，其特征是，所述 的装载液的组分为l/2MS、2mol · L-1甘油和0. 4mol · L-1蔗糖。
5.根据权利要求1所述的大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，其特征是，所述 的脱水处理是指将装载处理的原球茎在0°c下转到玻璃化溶液中脱水40min。
6.根据权利要求1所述的大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，其特征是，所 述的玻璃化溶液的组分及体积比为1/2MS、30%甘油、15%乙二醇、15% 二甲基亚砜和0.4mol · Γ1 蔗糖。
7.一种根据上述任一权利要求所述冷冻方法的解冻方法，其特征在于，通过将保存于 液氮中的原球茎置于40°C水浴中快速解冻lmin，然后用培养液洗涤后用无菌滤纸吸干表 面溶液后转入恢复培养基中进行恢复培养得以实现。
8.根据权利要求7所述的解冻方法，其特征是，所述的用培养液洗涤是指用含有1.2mol · L-1蔗糖的1/2MS培养液洗涤3次，每次间隔IOmin0
9.根据权利要求7所述的解冻方法，其特征是，所述的恢复培养基的组分及重量比为 1/2MS、6-BA0. 2mg · ΛΝΑΑΟ· 5mg · L-1 禾口 2%蔗糖。
10.根据权利要求7所述的解冻方法，其特征是，所述的恢复培养是指在恢复培养 基中先在黑暗环境下培养14d，然后转入光照强度为13081x环境下培养7d，光照时间为 16h · cf1，再置于光照强度为23361x环境下培养30d，光照时间为16h · cf1。
全文摘要
一种低温保存技术领域的大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法，通过将原球茎低温-高渗预处理后，转至装载液中并经脱水处理后转入装有玻璃化溶液的冷冻管中，并迅速投入液氮进行超低温保存。本发明为濒危的大苞鞘石斛种质资源保存提供了技术保证，将对石斛属植物甚至兰科植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。
文档编号A01N3/00GK102144633SQ20111005044
公开日2011年8月10日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者任丽, 吴元玲, 张荻, 申晓辉 申请人:上海交通大学