专利名称：一种制备奶牛性别控制精子的方法
技术领域：
本发明涉及性别控制精子的制备方法，具体地说，涉及一种奶牛性别控制精子的 制备方法。
背景技术：
性别控制(sex control)技术，即Χ/Υ精子分离技术，是利用X、Y精子中DNA 含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类 另|J，给液滴附加电荷，根据静电原理，将X、Y精子分离开来(例如，Johnson LA, Pinkel D. Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa. Cytometry 1986，7 :268 273)。该技术在畜牧生产中意义重 大，该技术可以按照生产需求人为地控制动物后代的性别，快速繁育高产家畜，加速家畜育 种进程，提高畜牧业的经济效益，促进畜牧业发展。在哺乳动物中，每一个体的X精子和Y精子，其DNA含量都是恒定的。根据研究， 所有哺乳动物X染色体的DNA含量都要高于Y染色体，相差大多在3. 6% -4. 2%之间。而 这种差异就是X和Y精子流式细胞仪分离的理论基础。其中奶牛X、Y精子差异为3. 8%， 猪为3. 6%，绵羊为4. 2%等多种哺乳动物X、Y精子DNA含量差异都已近获得。不同动物精子对温度的敏感性、精子膜上化学成分(如蛋白质和磷脂的比例以及 胆固醇和磷脂的比例和羟链的不饱和程度)等可能不同，而奶牛精子的抗冻能力比其他精 子的抗冻能力强，奶牛冷冻精子的人工授精的受胎率已达到85%以上。奶牛精清中的抗氧化物质会对原精有保护作用，但精子经过稀释处理后，这种保 护作用就会降低。此外，在奶牛性别控制精液的生产过程中会有大量的自由氧产生，且用 流式细胞仪分离精子会导致奶牛精子的受精能力降低，尤其是再经过低温存储或者在液氮 中冷冻保存之后，精子的受精能力会明显下降。同时经过分离的精子的存活时间会明显比 原精液存活时间短。这是由于精子质膜富含不饱和脂肪酸，且对自由氧超级敏感(Sikka 1996)，因此脂质氧化在精子功能上具有关键的作用，而分离及冷冻操作会造成脂质过氧 化，从而造成精子的损伤尤其是对精子顶体膜的损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备奶牛性别控制精子的方法。为了实现上述目的，本发明的制备奶牛性别控制精液的方法，其在奶牛精子分离 之前的缓冲液中加入2-0-葡糖糖苷抗坏血酸，然后用流式细胞分离仪分离奶牛精子，将分 离得到的奶牛性别控制精子回收到含有2-0-葡糖糖苷抗坏血酸的冷冻液中。本发明的上述制备方法中，所述AA-2G在缓冲液中的终浓度为150-250 μ M，优 选为200 μ M ；所述2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在所述冷冻液中的浓度为150-250 μ Μ,优选为 200 μ Μ。本发明中所述性别控制精液是将精子进行性别分离制得的单一性别精液。其是通过χ/Υ精子分离技术，利用X、Y精子中DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根 据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类别，然后给液滴附加电荷，根据静电原理，将Χ、Υ 精子分离开来，从而对精子进行性别分离，制得单一性别精液。 2-0-葡萄糖苷抗坏血酸(AA-2G)是抗坏血酸(VC)的一种衍生物，由于2位上有 葡萄糖基掩蔽，所以不易发生氧化，所以在水溶液中特别稳定，并且没有直接还原性。AA-2G 在酶的作用下能很快的释放出高活性的VC，能很快与自由基反应以降低脂质过氧化作用。 因此，在奶牛精子上分离机之前的缓冲液中和分离后的收集液中添加抗氧化剂AA-2G，能够 提高奶牛性控 精子的受精能力和存活时间，且该性控冷冻精液进行人工输精后受胎率达到 85%以上。 具体地说，本发明的制备奶牛性别控制精液的方法，包括如下步骤1)取一定量奶牛原精液，用!fepes缓冲液稀释至200 X IO6精子/mL，然后加入荧 光染料烟酸己可碱(H33342)至终浓度为0. IlmM及AA-2G至终浓度为150-250 μ M，在34°C 水浴中染色45min ；2)用含有重量体积比4%提纯卵黄和重量体积比5%食品红的!fepes缓冲液进一 步稀释至100 X IO6精子/mL;其中，添加食品红的目的是减弱死精子上的H33342荧光，使这部分精子在分离过 程中被弃除，提高分离精子的活力；3)然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离，回收分离得到的奶牛性别控 制精子，并收集在含有150-250 μ M AA-2G的冷冻液中；当精子收集到8 X IO6精子时，立刻 在4°C温度、840g下离心20min，弃掉上清；4)用含有AA-2G的冷冻液重新悬浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml
细管装管、密封。特别地，密封后的奶牛性别控制精子可以在15°C保存，也可以投入到液氮中冷冻， 制得冷冻精子。本发明中的冷冻液可以选用现有技术中常用的冷冻液，例如李喜和主编的《家畜 性别控制技术》(北京科学出版社，2009)中公开的冷冻I液、冷冻II液等，其中冷冻I液 可以按如下配比进行配制首先配置Tris-A工作液50ml Tris-AU. 766g Trisma Base、 0. 8615g柠檬酸、0. 6325g D-果糖，搅拌30min，再加入超纯水50ml，调节pH为6. 8,0. 22 μ m 过滤除菌，5°C保存可供14天使用；其次配置25ml 20%卵黄Tris-A液19. 9ml Tris-A工 作液、5. Iml卵黄液，搅拌15min，5°C温度下12h析出沉淀，静止后析出表面卵脂，并在3850g 的条件下离心5min，取上清再过滤灭菌，5°C保存可供7天使用。本发明中所提到的重量体积比的单位均为g/ml。通过本发明方法制得的奶牛性别控制精子可以进行人工输精、或直接冷冻保存。本发明的优点在于，本发明通过在奶牛精子分离之前的缓冲液中和分离后的收集 冷冻液中添加抗氧化剂AA-2G，制得奶牛性别控制精子。由于AA-2G在水溶液中很稳定，因 此奶牛性别控制精子在分离过程中的损伤能在很大程度得到避免，能够提高精子品质、提 高精子的受精能力，还能够延长存活时间；本发明的制备方法操作简单，能够广泛应用于商 业化推广中，具有广阔的市场前景。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实 施例中的重量体积比的单位均为g/ml。实施例11、取一定量奶牛原精液，用!fepes缓冲液稀释至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至终浓度为0. IlmM及AA-2G至终浓度为150 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量体积比)提纯卵黄和5% (重量体积比)食品红的Ifepes缓 冲液进一步稀释至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离和回收，分离后的精液收集在 含有250 μ M AA-2G的冷冻I液中；当精子收集到8\106精子时，立刻在840g下离心20min，
弃掉上清；4、用含有AA-2G的冷冻I液重新悬浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 细管装管，密封后在15°C保存。实施例21、取一定量奶牛原精液，用!fepes缓冲液稀释至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至终浓度为0. IlmM及AA-2G至终浓度为250 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量体积比)提纯卵黄和5% (重量体积比)食品红的Ifepes缓 冲液进一步稀释至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离和回收，分离后的精液收集在 含有150 μ M AA-2G的冷冻I液中；当精子收集到8\106精子时，立刻在840g下离心20min，
弃掉上清；4、用含有AA-2G的冷冻I液重新悬浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 细管装管，密封后在15°C保存。实施例31、取一定量奶牛原精液，用!fepes缓冲液稀释至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至终浓度为0. IlmM及AA-2G至终浓度为200 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量体积比)提纯卵黄和5% (重量体积比)食品红的Ifepes缓 冲液进一步稀释至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离和回收，分离后的精液收集在 含有200 μ M AA-2G的冷冻I液中；当精子收集到8\106精子时，立刻在840g下离心20min，
弃掉上清；4、用含有AA-2G的冷冻I液重新悬浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 细管装管，密封后在15°C保存。实施例4缓冲液中加入AA-2G的作用根据实施例1的制备方法同时进行了 4组试验，其中对照组在分离前的缓冲液中 不添加任何抗氧化剂、A组添加AA-2G ；M组添加褪黑素；E组添加维生素E。各组抗氧化剂 的用量如表1所示，并用等量hepes缓冲液溶解，其余步骤及条件均与实施例1相同。将制 得的牛性别控制精液在37°C条件下，荧光显微镜检测精子活力，结果如表1所示。表1不同抗氧化剂对奶牛精子活力及存活时间的影响
权利要求
1.一种制备奶牛性别控制精子的方法，其特征在于，在奶牛精子分离之前的缓冲液中 加入2-0-葡糖糖苷抗坏血酸，然后用流式细胞分离仪分离奶牛精子，将分离得到的奶牛性 别控制精子回收到含有2-0-葡糖糖苷抗坏血酸的冷冻液中。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在缓冲 液中的终浓度为150-250 μ M。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在缓冲 液中的终浓度为200 μ Μ。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在所述 冷冻液中的浓度为150-250 μ Μ。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在所述 冷冻液中的浓度为200 μ Μ。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)取一定量奶牛原精液，用Hepes缓冲液稀释至200X IO6精子/mL，然后加入荧光染料 烟酸己可碱至终浓度为0. IlmM及2-0-葡糖糖苷抗坏血酸至终浓度为150-250 μ M，在34°C 水浴中染色45min ；2)用含有重量体积比4%提纯卵黄和重量体积比5%食品红的!fepes缓冲液进一步稀 释至100 X IO6精子/mL;3)然后用流式细胞分离仪进行奶牛精子分离，回收分离得到的奶牛性别控制精子，并 收集在含有150-250μΜ 2-0-葡糖糖苷抗坏血酸的冷冻液中；当精子收集到8 X IO6精子 时，立刻在4°C温度、840g下离心20min，弃掉上清；4)用含有AA-2G的冷冻液重新悬浮沉淀物，以每管精子密度3X IO6精子0. 25ml细管 装管，密封。
全文摘要
本发明提供了一种制备奶牛性别控制精子的方法，其是在奶牛精子分离之前的缓冲液中加入2-O-葡糖糖苷抗坏血酸，然后用流式细胞分离仪分离奶牛精子，将分离得到的奶牛性别控制精子回收到含有2-O-葡糖糖苷抗坏血酸的冷冻液中。本发明的优点在于，本发明通过在奶牛精子分离之前的缓冲液中和分离后的精子收集液中添加抗氧化剂AA-2G来制备奶牛性别控制精子，能够避免奶牛性别控制精子在性别分离处理过程中的损伤，提高精子品质及精子的受精能力，还能够延长存活时间；本发明的制备方法操作简单，能够广泛应用于商业化推广中，具有广阔的市场前景。
文档编号A01N1/02GK102144631SQ201110059938
公开日2011年8月10日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者吴中红, 夏春梅, 安磊, 杨升, 田见晖 申请人:中国农业大学