专利名称：：奶牛x/y性别控制冷冻混合精液及其制备方法
技术领域：
：本发明属于家畜人工授精
技术领域：
，涉及奶牛性别控制冷冻精液生产的新技术，更具体的说是奶牛X/Y性别控制冷冻混合精液及其制备方法。
背景技术：
：哺乳动物的性别控制一直是生命科学中的重要研究课题之一,随着分子生物学、细胞遗传学、发育生物学、免疫组织化学等学科的发展，人们对性别决定的机理有了进一步的认识。性别控制技术是指通过对动物的正常生殖进行人为干预与操作，使成年雌性动物按照人们的意愿生产出特定性别后代的生物技术。控制哺乳动物性别以生产更多期望性别的后代，对于提高畜牧业的生产效益、推动基础研究发展具有十分重要的理论和实践意义。人们往往通过调控性别决定基因、分离X、Y精子、鉴定胚胎性别与选择性移植、选择性妊娠、控制环境因子等途径来实现性别控制，其中X、Y精子分离是最直接、最有效的方法而倍受重视。近年来性别控制技术的研究与应用成为生物繁殖技术研究的热点，尤其是奶牛的性别控制。奶牛性别控制技术的途径主要有3条:一是利用分离的X/Y精子对奶牛进行人工授精或生产体内、体外胚胎;二是利用性别鉴定后的胚胎移植技术;三是通过药物等控制输精时间与母牛的生殖道内环境来实现。精子分离或胚胎的性别鉴定的基础设想是找出X和Y精子、或者是雌、雄胚胎的不同之处，包括形态、理化性质、染色质容量。以及遗传水平的基因差别、然后根据这些区别设计出确实有效的分离或鉴定方法。细胞流式分离法的原理是根据X、Y精子DNA含量的微小差别(约为3—5%)，通过荧光色素把精子头部染色后被激光(laser)照射时的荧光发光量差别传送到计算机的识别系统，然后控制系统在通过电极区间时赋电后把X和Y精子偏开、并流入分别的接受容器内。世界上掌握奶牛、肉牛X/Y性别控制冷冻精液生产技术的仅有美国、加拿大、英国、日本、澳大利亚、中国等8个国家。各国在奶牛生产中积极研究和应用精子分离、胚胎性别鉴定和控制受孕环境等方法，人为控制奶牛后代性别，选择性生产母犊，提高奶牛养殖效益。目前中国奶牛总数为1400万头，但是良种奶牛只占不到三分之一，因此市场上良种奶牛公、母犊价格悬殊10倍以上，广大奶农迫切希望提高奶牛母犊生育率。但是，正常情况下，奶牛繁殖公、母犊的机率各占一半。为此，分离的X/Y精子可广泛用于种畜人工受精和生产性别控制胚胎，使奶牛和肉牛良种的改良和繁育周期大为缩短，降低奶牛和肉牛良种的生产成本，将有力推动我国种畜良种推广工作，有效满足国内市场对良种奶牛的需求。以DNA含量差别为基础的X/Y精子分离技术虽然已经在家畜繁育领域推广应用，但是由于每台精子分离机造价十分昂贵，技术操作复杂，并且X/Y精子分离速度仍然十分有限(5000-6000个精子/秒)，使奶牛性别控制冷冻精液生产成本髙、无法大量推广应用。
发明内容本发明提供了一种奶牛X/Y性别控制冷冻混合精液的生产新技术，主要内容包括奶牛X/Y精子分离、基础山羊精液的配置、按照要求通过两种精液混合和冷冻程序生产奶牛性别控制冷冻精液。可以使以X/Y精子分离为基础的奶牛性别控制冷冻精液的生产效率提高2-4倍，同时降低生产成本50-70%。本发明所述的山羊精液可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替。为达到上述目的本发明提供了如下的技术方案一种奶牛性别控制冷冻混合精液，其特征在于它是由200-300万个/0.251111山羊精液，50-100万个/0.25加1分离X/Y精液，12-20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液共同组成，其中山羊精子与分离的牛X/Y精子数量份数比为1:0.5-0.17(山羊精子牛精子=200万100万，或者是300万50万)；所述的冷冻混合精液的精子综合活力为0.4-0.6,精子综合存活时间为6-8小时。山羊精液可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替。本发明所述奶牛性别控制冷冻混合精液，其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8，包括组成如下三羟甲基氨基甲垸(TRIS)291.7mM柠檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%去离子超纯水按照用量和比例添加采用本发明公开的奶牛性别控制冷冻混合精液生产的奶牛X/Y性别控制冷冻精液的技术指标如下-X/Y性别控制冷冻精液的技术指标规格每支(U5ml冷冻管200-300万个山羊精子加50-100万个X/Y奶牛精子(山羊精液可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替)。精子综合活力0.4-0.6精子综合存活时间6-8小时人工授精平均情期受胎率50-60%性别控制准确率90%以上本发明进一步公开了奶牛性别控制冷冻精液的制备方法，包括如下的步骤1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，然后检测其各项指标符合以下要求原精浓度为8-10亿个/ml，原精活力在85%以上；②用精子染色液TALP(托尔普染色液，含有提供精子能量的糖类等渗透压缓冲液)把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加lOiil的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342(购于美国Sigma公司)，在24'C温水浴中培育20分钟，同时添加2.5%的食品红染色死精子(在分离时识别并清除死精子)；③按照精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，以每秒4500-7000个的速度分取X或Y精子；④X或Y精子的回收液为含4。/。卵黄的Tris液。每1000-1200万个分取精子下机后离心处理，用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的X或Y精子稀释到每毫升800-1600万个，在4'C条件下平衡90分钟；2)基础山羊精液的配置①采集山羊种公羊新鲜精液，用80nm精子过滤器除去原精液中的杂质，然后检测其各项指标符合以下要求原精浓度为10-15亿个/ml，原精活力在85%以上；②用含20。/。卵黄的Tris稀释液把山羊精液稀释到每毫升3200-4800万个，并置于4'C条件下保存(可供使用10-12小时)；③山羊精液可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替。3)精液混合和冷冻保存①把平衡后的分离奶牛X或Y精液与上述每毫升含有3200-4800万个精子的山羊精液在4'C条件下等量混合(精液混合的容量相同，但其中的山羊和分离的奶牛X/Y精子密度不同)，使分离X或Y奶牛精液浓度稀释为每毫升400-800万个、山羊精液浓度稀释为每毫升1600-2400万个；②混合后的精液立刻与等量的含12-20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液。加入的量根据每批样品中的精子总数确定，最终以达到使分离X或Y奶牛精液浓度进一步稀释为每毫升200-400万个、山羊精液浓度稀释为每毫升800-1200万个，并在4'C冰箱平衡30分钟；③处理后的混合精液在4-C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X或Y精子50-100万个、山羊精子200-300万个；把每50-100支0.25ml冷冻管装入冷冻板，移至-卯'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C，然后投入-196'C液化氮中作为奶牛性别控制冷冻混合精液产品保存。⑤山羊精液可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替。本发明以山羊精子作为基础，加入不同比例的奶牛分离X/Y精子(山羊精子奶牛分离XZY精子-200-300万个/0.251111:50-100万个/0.25ml)来生产奶牛X/Y性别控制冷冻精液。同时观察比较了该技术分离X/Y精液对牛精子冻后活率、体外存活时间、牛性别控制冻精配种产续结果的影响，祥见表1和表2(混合冷冻精液生产和人工授精结果见实施例1，2,3，4，5，6)。山羊精液可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替。表1:分离X/Y精液对牛精子冻后活率和体外存活时间<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:牛性别控制X冻精配种产续结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结论根据该发明技术生产的奶牛X/Y性控冷冻精液，与标准指标相比，其精子活力和解冻后精子存活时间两项指标明显提髙，并且与常规精液相比具有相同的受胎能力，性控准确率为93.6%。本发明进一步公开了冷冻混合精液在制备奶牛、肉牛性别控制冷冻混合精液生产方面的应用。本发明的奶牛性别控制冷冻精液与目前的现有技术相比所具有的积极效果在于(1)本发明提供的奶牛X/Y性别控制冷冻混合精液生产技术，可以使以X/Y精子分离为基础的奶牛性别控制冷冻精液的生产效率在现有条件下提高2-4倍，同时降低生产成本50-70%。(2)可以使奶牛平均情期受胎率在60%以上，超出设计标准约10_15%。(3)本发明提高了冻精解冻后精子的活力和延长了冻精解冻后的存活时间，使情期母牛性别控制准确率达到93%以上。(4)本技术发明也适用肉牛性别控制冷冻混合精液的生产。具体实施例方式下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明。但不以任何方式限制本发明，本发明实施例中的份数可以根据实际的需要加以选择为克或公斤。实施例l:100万个/0.251111奶牛乂性别控制冷冻精液制作和人工授精1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液3.6ml,用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测原精浓度为9.4亿个/ml，原精活力为85°/0;②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加10ul的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342(购于美国Sigma公司)，在24°C温水浴中培育20分钟，同时添加2.5%的食品红染色死精子(在分离时识别并清除死精子)；③按照SX-MoFlo精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，X精子分离速度稳定在每秒5000-5500个；以每小时一次回收1200万个X精子的速度，把分离后的X精子离心处理后再用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的X精子稀释到每毫升1600万个；2)基础山羊精液的配置采集山羊种公羊新鲜精液2.41111，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测其原精浓度为1L8亿个/1111,原精活力为87%;②用含20。/。卵黄的Tris稀释液把山羊精液稀释到每毫升3200万个，并置于4'C条件下保存(可供使用12小时)；3)精液混合和冷冻保存①每4小时把分离后的X精子集中起来，按照每毫升含分离X精液子为800万个、每毫升含山羊精子为1600万个的密度比例，以等容量比例在4'C条件下与等量的处理山羊精液混合(山羊精液与分离的X精子数量份数比为1:0.5);②混合后的精液立刻加入等量的含12%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液，使分离X精液浓度进一步稀释为每毫升400万个、山羊精液浓度稀释为每毫升800万个，并在4'C冰箱平衡30分钟；其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8，包括组成如下三羟甲基氨基甲垸(TRIS)291.7mM柠檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%超纯水按照用量和比例添加③处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X精子100万个、山羊精子200万个；④把0,25ml冷冻管装入冷冻板，移至-90'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C，然后投入-196'C液化氮中作为产品保存。本次奶牛原精进行8小时分离处理，合计生产X性别控制冷冻精液89支。精子综合活力为0.6，精子综合存活时间为8小时，祥见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4)人工受精结果取80支奶牛X性别控制冷冻精液以单侧子宫体深部人工输精技术，配种发情受体母牛80头，平均情期受胎率为58%(46/80)，出生奶牛母犊43头，性别控制准确率为93%。实施例2:50万个/0.251111奶牛乂性别控制冷冻精液制作和人工授精1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液3.2ml，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测原精浓度为8.0亿个/1111，原精活力为88%;②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加lOiil的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342，在24'C温水浴中培育20分钟(同时添加适量的食品红并除去染色死精子)；③按照SX-MoFlo精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，X精子分离速度稳定在每秒5500-6000个；④以每小时一次回收1200万个X精子的速度，把分离后的X精子离心处理后再用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的X精子稀释到每毫升800万个；2)基础山羊精液的配置①采集山羊种公羊新鲜精液2.81111，用80iim精子过滤器除去原精液中的杂质，检测其原精浓度为12.0亿个/1111，原精活力为87%;@用含20%卵黄的Tris稀释液把山羊精液稀释到每毫升4800万个，并置于4'C条件下保存(可供使用12小时)；3)精液混合和冷冻保存①每4小时把分离后的X精子集中起来，与等量的处理山羊精液在4'C条件下混合，使分离X精液浓度稀释为每毫升400万个、山羊精液浓度稀释为每毫升2400万个;②混合后的精液立刻加入等量的含20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液，使分离X精液浓度进一步稀释为每毫升200万个、山羊精液浓度稀释为每毫升1200万个，并在4'C冰箱平衡30分钟。③处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X精子50万个、山羊精子300万个；其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8,包括组成如下三羟甲基氨基甲烷(TRIS)291.7mM柠檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%去离子超纯水按照用量和比例添加@把0.25加1冷冻管装入冷冻板，移至-卯'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C，然后投入-196'C液化氮中作为产品保存。该奶牛原精进行4小时分离处理，合计生产X性别控制冷冻精液113支。精子综合活力为0.5，精子综合存活时间为8小时，祥见表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4)人工受精结果取100支奶牛X性别控制冷冻精液以单侧子宫体深部人工输精技术，配种发情受体母牛100头，平均情期受胎率为56。/。(56/100),出生奶牛母犊52头，性别控制准确率为92%。实施例3:100万个/0.251111肉牛Y性别控制冷冻精液制作和人工授精1)X/Y精子分离①采集新鲜肉牛种公牛精液2.8ml,用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测原精浓度为14.8亿个/ml，原精活力为90%;②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加lOul的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342，在24'C温水浴中培育20分钟(同时添加适量的食品红并除去染色死精子)；③按照SX-MoFlo精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，Y精子分离速度稳定在每秒6000-7000个；④以每小时一次回收1200万个Y精子的速度，把分离后的Y精子离心处理后，再用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的Y精子稀释到每毫升1600万个；2)基础山羊精液的配置①采集山羊种公羊新鲜精液2.4ml，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测其原精浓度为14.8亿个/1111,原精活力为85%;②用含20。/。卵黄的Tris稀释液把山羊精液稀释到每毫升3200万个，并置于4'C条件下保存(可供使用12小时)；3)精液混合和冷冻保存①每4小时把分离后的Y精子集中起来，与等量的处理山羊精液在4'C条件下混合，使分离Y精液浓度稀释为每毫升800万个、山羊精液浓度稀释为每毫升1600万个；②混合后的精液立刻加入等量的含20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液，使分离Y精液浓度进一步稀释为每毫升400万个、山羊精液浓度稀释为每毫升800万个，并在4'C冰箱平衡30分钟。③处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的肉牛Y精子100万个、山羊精子200万个；其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8，包括组成如下三羟甲基氨基甲垸(TRIS)291.7mM柠檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%去离子超纯水按照用量和比例添加④把0.25ml冷冻管装入冷冻板，移至-卯'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C，然后投入-196'C液化氮中作为产品保存。该肉牛原精进行8小时分离处理，合计生产Y性别控制冷冻精液186支。精子综合活力为0.6，精子综合存活时间为10小时，祥见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4)人工受精结果取180支肉牛Y性别控制冷冻精液以单侧子宫体深部人工输精技术，配种发情受体母牛180头，平均情期受胎率为58%(105/180)，出生肉牛公犊99头，性别控制准确率为94%。实施例4:100万个/0.251111奶牛X性别控制冷冻精液制作和人工授精1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液4.0ml，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测原精浓度为9.8亿个/ml，原精活力为85%;②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加10ul的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342，在24'C温水浴中培育20分钟(同时添加适量的食品红并除去染色死精子)；③按照SX-MoF，o精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，X精子分离速度稳定在每秒5000-6000个；④以每小时一次回收1200万个X精子的速度，把分离后的X精子离心处理后，再用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的X精子稀释到每毫升1600万个；2)基础猪精液的配置①采集公猪新鲜精液15ml,用80nm精子过滤器除去原精液中的杂质，检测其原精浓度为1.2亿个/ml，原精活力为85%;②用含20。/。卵黄的Tris稀释液把猪精液稀释到每毫升3200万个，并置于4'C条件下保存(可供使用12小时)；3)精液混合和冷冻保存①每4小时把分离后的X精子集中起来，与等量的处理猪精液在4'C条件下混合，使分离X精液浓度稀释为每毫升800万个、猪精液浓度稀释为每毫升1600万个；②混合后的精液立刻加入等量的含20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液，使分离X精液浓度进一步稀释为每毫升400万个、猪精液浓度稀释为每毫升800万个，并在4'C冰箱平衡30分钟。③处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X精子100万个、猪精子200万个；其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8,包括组成如下三羟甲基氨基甲垸(TRIS)291.7mM柠檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%去离子超纯水按照用量和比例添加④把0.25ml冷冻管装入冷冻板，移至-卯'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C,然后投入-196'C液化氮中作为产品保存。该奶牛原精进行8小时分离处理，合计生产X性别控制冷冻精液250支。精子综合活力为0.58，精子综合存活时间为9小时，祥见表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4)人工受精结果取100支奶牛X性别控制冷冻精液以单侧子宫体深部人工输精技术，配种发情受体母牛100头，平均情期受胎率为57%(57/100),出生奶牛母犊54头，性别控制准确率为95%。实施例5:100万个/0.251111奶牛X性别控制冷冻精液制作和人工授精1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液3.3ml，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测原精浓度为11.4亿个/ml，原精活力为90%;②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml,取4ml该稀释精液添加l(hil的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342，在24。C温水浴中培育20分钟(同时添加适量的食品红并除去染色死精子)；③按照SX-MoFlo精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，X精子分离速度稳定在每秒6000-7000个；④以每小时一次回收1200万个X精子的速度，把分离后的X精子离心处理后，再用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的X精子稀释到每毫升1600万个；2)基础鹿精液的配置①采集公鹿新鲜精液2.8ml，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测其原精浓度为7亿个/ml，原精活力为90%;②用含20。/。卵黄的Tris稀释液把鹿精液稀释到每毫升3200万个，并置于4'C条件下保存(可供使用12小时)；3)精液混合和冷冻保存①每4小时把分离后的X精子集中起来，与等量的处理鹿精液在4'C条件下混合，使分离X精液浓度稀释为每毫升800万个、鹿精液浓度稀释为每毫升1600万个；②混合后的精液立刻加入等量的含20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液，使分离X精液浓度进一步稀释为每毫升400万个、鹿精液浓度稀释为每毫升800万个，并在4'C冰箱平衡30分钟。③处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X精子100万个、鹿精子200万个；其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8，包括组成如下三羟甲基氨基甲垸(TRIS)291.7mM拧檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%去离子超纯水按照用量和比例添加④把0.25ml冷冻管装入冷冻板，移至-90'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C，然后投入-196'C液化氮中作为产品保存。该奶牛原精进行8小时分离处理，合计生产X性别控制冷冻精液160支。精子综合活力为0.6，精子综合存活时间为10小时，祥见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4)人工受精结果取120支奶牛X性别控制冷冻精液以单侧子宫体深部人工输精技术，配种发情受体母牛120头，平均情期受胎率为63%(77/120),出生奶牛母犊74头，性别控制准确率为96%。实施例6:100万个/0.251111奶牛X性别控制冷冻精液制作和人工授精1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液4.51111，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，检测原精浓度为9.4亿个/ml，原精活力为85%;②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加10nl的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342,在24'C温水浴中培育20分钟(同时添加适量的食品红并除去染色死精子)；③按照SX-MoFlo精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，X精子分离速度稳定在每秒5000-6000个；④以每小时一次回收1200万个X精子的速度，把分离后的X精子离心处理后，再用含20%卵黄的Tris稀释液把分离的X精子稀释到每毫升1600万个；2)基础马精液的配置①采集公马新鲜精液23ml，用80nm精子过滤器除去原精液中的杂质，检测其原精浓度为1.4亿个/ml，原精活力为85%;②用含20%卵黄的Tris稀释液把马精液稀释到每亳升3200万个，并置于4'C条件下保存(可供使用12小时)；3)精液混合和冷冻保存①每4小时把分离后的X精子集中起来，与等量的处理马精液在4'C条件下混合，使分离X精液浓度稀释为每毫升800万个、马精液浓度稀释为每毫升1600万个；②混合后的精液立刻加入等量的含20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液，使分离X精液浓度进一步稀释为每毫升400万个、马精液浓度稀释为每毫升800万个，并在4'C冰箱平衡30分钟。(D处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X精子100万个、马精子200万个；其中的Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8，包括组成如下三羟甲基氨基甲垸(TRIS)291.7mM拧檬酸95.1mM果糖70.2mM卵黄20%甘油(第二次稀释)12%去离子超纯水按照用量和比例添加④把0.25ml冷冻管装入冷冻板，移至-90'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C,然后投入-196'C液化氮中作为产品保存。该奶牛原精进行8小时分离处理，合计生产X性别控制冷冻精200支。精子综合活力为0.54，精子综合存活时间为10小时，祥见表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4)人工受精结果取140支奶牛X性别控制冷冻精液以单侧子宫体深部人工输精技术，配种发情受体母牛140头，平均情期受胎率为54%(76/140)，出生奶牛母犊73头，性别控制准确率为95%。在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。权利要求1、一种奶牛性别控制冷冻混合精液，其特征在于它是由200-300万个/0.25ml山羊精液，50-100万个/0.25ml分离奶牛X/Y精液，12-20％甘油冷冻保护剂和20％卵黄的Tris-冷冻平衡液共同组成，其中山羊精子与分离的牛X/Y精子数量份数比为10.5-0.17；所述的冷冻混合精液的精子综合活力为0.4-0.6，精子综合存活时间为6-8小时；其中的山羊精液也可被同等数量的猪、马或鹿的精液代替。2、权利要求l所述的奶牛性别控制冷冻精液，其中所述Tris-冷冻平衡液指的是在20'C或4'C条件下能使精子生理功能保持稳定的等渗透压溶液；冷冻平衡液pH为6.8，包括组成如下三羟甲基氨基甲垸柠檬酸田被术概卵黄甘油第二次稀释去离子超纯水291.7mM95.1mM70.2mM20%12%按照用量和比例添加,3、权利要求l所述的奶牛性别控制冷冻精液，其中所述的奶牛X或Y精液的重量份数比为l:1。4、权利要求1所述的奶牛性别控制冷冻精液，其中加入的12-20%甘油冷冻保护剂/20%卵黄的Tris-冷冻平衡液与冷冻混合精液等量。5、一种制备权利要求1所述奶牛性别控制冷冻精液的方法，其特征在于，包括如下的方法1)X/Y精子分离①采集新鲜奶牛种公牛精液，用80um精子过滤器除去原精液中的杂质，然后检测其各项指标符合以下要求原精浓度为8-10亿个/ml，原精活力在85%以上；②用精子染色液TALP把原精液稀释到1亿个/ml，取4ml该稀释精液添加10ul的15mg/ml的精子DNA荧光染色剂Hochist33342，在24。C温水浴中培育20分钟，同时添加适量的食品红染色并除去死精子；③按照SX-MoFlo或SXXDP-MoFlo精子分离机操作程序，把染色处理的精子样品植入样品台内，以每秒2万个精子的速度喷流精子，以每秒4000-7000个的速度分取X或Y精子；④X或Y精子的回收液为含4。/。卵黄的Tris稀释液，每1000-1200万个分取精子下机后在4匸条件下平衡90分钟，离心处理后再用含20%卵黄的Tris平衡液把分离的X或Y精子稀释到每毫升800-1600万个；2)基础山羊精液的配置①采集山羊种公羊新鲜精液，按照i:l的比例把原精与Tris原液等量稀释后并用8(him精子过滤器除去原精液中的杂质，然后检测其各项指标符合以下要求原精浓度为10-15亿个/ml，原精活力在85%以上；②检测合格的山羊新鲜精液，用含20%卵黄的Tris稀释平衡液把山羊精液稀释到每毫升3200-4800万个，并置于4'C条件下保存；③山羊精液可用同等数量的猪、马或鹿的精液代替；3)精液混合和冷冻保存①把平衡后的分离奶牛X或Y精液与上述每毫升含有3200-4800万个精子的山羊精液在4'C条件下等量混合，使分离X或Y奶牛精液浓度稀释为每毫升400-800万个、山羊精液浓度稀释为每毫升1600-2400万个；②混合后的精液立刻与等量的含12-20%甘油冷冻保护剂和20%卵黄的Tris-冷冻平衡液;加入的量根据每批样品中的精子总数确定，最终以达到使分离X或Y奶牛精液浓度进一步稀释为每毫升200-400万个、山羊精液浓度稀释为每毫升800-1200万个，并在4'C冰箱平衡30分钟；③处理后的混合精液在4'C条件下装入0.25ml冷冻管，每支产品中包含分离的奶牛X或Y精子50-100万个、山羊精子200-300万个；把每50-100支0.25ml冷冻管装入冷冻板，移至-90'C液化氮气中经20分钟降温至-120'C，然后投入-196'C液化氮中作为奶牛性别控制冷冻混合精液产品保存；⑤山羊精液可用同等数量的猪、马或鹿的精液代替。6、权利要求l所述的冷冻混合精液在制备奶牛、肉牛性别控制冷冻混合精液生产方面的应用。全文摘要本发明公开了一种奶牛性别控制冷冻混合精液的生产新技术。它是以山羊精液作为基础(200-300万个/0.25ml)，加入不同比例的分离X/Y精液(50-100万个/0.25ml)，来生产奶牛X/Y性别控制冷冻精液。主要内容包括奶牛X/Y精子分离、基础山羊精液的配置(也可以用同等数量的猪、马或鹿的精液代替)、按照要求通过两种精液混合和冷冻程序生产奶牛性别控制冷冻精液。该技术可以使奶牛X/Y性别控制冷冻精液的生产效率提高2-4倍，同时降低生产成本50-70％。本发明提高了冻精解冻后精子的活力、顶体完整率，延长了冻精解冻后具有授精能力的时间，使母牛的平均情期受胎率达到50％以上，性别控制准确率达到90％以上。本技术发明也适用肉牛性别控制冷冻混合精液的生产。文档编号A61P15/00GK101411722SQ200810180820公开日2009年4月22日申请日期2008年11月25日优先权日2008年10月22日发明者周文忠,张元炜,李喜和,王建国,钱松晋申请人:李喜和