专利名称：一种检测牛x、y精子分离纯度的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说，涉及一种检测牛X、Y精子分离纯度的方法。
背景技术：
性别控制在畜牧生产中有着巨大的应用价值，借助于性别控制技术，可选择不同 性别的家畜满足生产需要，X、Y精子分离是性别控制最根本的技术手段，同时X、Y精子分离 的准确程度直接关系到性别控制的效果，所以快速、准确的评价体系的建立有利于分离方 法的优化与提高，更关系到性别控制技术的可信度，有助于性控精液的推广与市场普及。目前对于分离后精子纯度鉴定主要采用流式细胞仪重分析评价法和荧光原位杂 交评价法(Fluorescent In Site Hybridization, FISH)。流式细胞仪重分析评价法流式细胞仪重分析评价法，将分离后的精子先超声断尾，仅留下精子头部，以增加 精子的定向效应；然后用荧光染料Hoechst33342进行染色体染色，使染料定量地与DNA重 新结合，精子以100 200个/秒的速度通过流式细胞仪进行重分析。虽然流式细胞仪重 分析评价法准确，但是受到专用仪器的限制，也牺牲了很多宝贵的机时，X精子和Y精子DNA 含量差别很小时，流式细胞重分析不能保证准确性，采用同一台仪器进行分离结果的评价 分析，也可能造成结果的偏差，同时流式细胞仪价格昂贵，很多实验室不能够配备。荧光原位杂交(FISH)评价法FISH是在细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的一种检测 技术，是利用碱基互补原理，将标记上非放射性荧光物质(如荧光素、DAPI等)的染色体特 异核酸探针与细胞核中的染色体序列杂交。荧光原位杂交评价法由于使用了染色体特异探 针等，可以得到高质量的鉴定结果；同时探针稳定，荧光试剂安全。但是FISH评价法要求在 短时间内制备很多样品，无形中增加了劳动量，完成整个鉴定过程需要较长时间，同时荧光 试剂价格昂贵，不利于此技术的推广应用。因此，非常有必要建立一种准确、快速、经济的检测X、Y精子分离纯度的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种可检测牛单精子性别的特异PCR扩增引物。本发明的另一个目的在于提供一种利用上述引物检测X、Y精子分离纯度的PCR方法。本发明针对牛牙釉基因在X、Y染色体上的等位基因序列(GI :29126030和GI 29126032，序列报道长度分别为6451bp和6264bp)设计了能够检测到牙釉基因在不同性别 精子间等位基因长度多态的特异引物AML395，其核苷酸序列如表1所示(也见随附的序列 表 SEQ ID NO. 1&2)表1引物AML395序列及相关信息
引物代号引物序列引物Tm值GC含产物长度(。C)量(％)长度AML395F: TTCTCACCAGTACCCTTCCTA R.-TCAGAGGCAGGTCAGGAAGCA21 2162 6847.6 61.9395bp(Y) 458bp(X)利用上述引物，对单个牛精子进行简单PCR扩增，然后检测扩增产物长度，扩增产 物长度为458bp的单精子为X精子，扩增产物长度为395bp的单精子为Y精子。应用本发明引物建立的检测单精子性别的方法，包括单精子的分离，单精子的裂 解，PCR扩增和电泳检测，扩增产物长度为458bp的单精子为X精子，扩增产物长度为395bp 的单精子为Y精子。应用本发明引物建立的检测单精子性别的方法，包括单精子的分离，单精子的裂 解，PCR扩增、电泳检测和结果统计五个环节。具体地说，本发明采用高浓度的碱性裂解液(500mmol/L KOH, 125mmol/L DTT)裂 解精子，每管单精子加1 1. 3uL碱性裂解液，65°C裂解lOmin，然后将中和液(900mmol/L Tris-HCl, pH8. 3，每管单精子2. 3 2. 8uL)直接加入除模板以外的总反应体系，通常采 用25ii LPCR反应体系，其中Taq酶1. 5U，dNTP浓度为200 y mol/L，引物浓度为180pmol/ L,各离子浓度分别为 90mmol/L Tris_HCl、30mmol/LKCl 和 1. 5mmol/L MgCl2。扩增产物采 用GoldViewna 〗荧光染料(灵敏度比EB高10倍左右)染色观察。本发明进一步提供一 种用于上述PCR扩增的优化PCR反应程序，该反应程序为94°C预变性3min ；然后94°C IS, 55°C 1S，循环29次；最后72°C延伸3min。利用本发明的方法，扩增产物分别为长395bp的Y染色体等位基因特异产物和长 458bp的X染色体等位基因特异产物。通过对单精子DNA模板扩增，检测扩增产物，如扩增 产物长度为395bp则表明该精子为Y精子，如检测到了长度为458bp的产物条带则表明被 检测精子为X精子。由于不论是X精子还是Y精子都能检测到特异产物，所以不会产生假 阳性和假阴性，因此避免了由于使用内标引物带来的复杂双重PCR和较难的技术操作，检 测过程更加简便，检测结果也更加灵敏、可靠。本发明利用牛牙釉基因在性染色体上的两个等位基因存在序列长度多态特点，在 相应位点上设计了一对引物，采用快速PCR方法对单个精子牙釉基因的等位基因进行扩增 检测，可在Y精子中检测到长约395bp的Y染色体特异产物条带，在X精子中检测到长约 458bp的X染色体特异产物条带，利用两个染色体特异扩增产物长度的差异通过琼脂糖凝 胶电泳结果进行单个精子性别鉴定。还可以通过对分离精液中各牛精子进行简单PCR扩增 和琼脂糖凝胶电泳，然后根据对单个精子性别检测结果的统计分析，对分离精子纯度做出 最终评价。本发明同时通过改变传统PCR反应的扩增条件，而实现30 40分钟左右完成PCR 扩增。本发明不涉及任何专有仪器，只利用现有常规仪器和国产化试剂即可实现检测目的， 降低了检测成本，此外，本领域的一般技术人员均可实施本发明。本发明的方法能够实现牛分离X、Y精液纯度的快速PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测分析，为现有牛X、Y精子分离技术的迅速提高及精子分离新方法的探索提供快速灵敏的 技术支持，并有助于性别控制精液的应用与推广，从而在牛繁殖过程中推动性别控制技术 的应用。
图1为公牛和母牛血液及公牛精液DNA的PCR扩增产物电泳图，其中，bl_b8泳道 为母牛血液PCR扩增结果，al-a4为公牛血液PCR扩增结果，cl-c4泳道为公牛精液DNA的 PCR扩增结果，ck为阴性对照；图2为从常规精液中随机挖取单精子的PCR扩增产物检测结果，其中1-10泳道为 单精子扩增结果(1_3、6、9为X精子，4、5、7、8、10为Y精子)，CK道为阴性对照；图3为从分离的X精液中随机挖取单精子的PCR扩增产物检测结果，其中11、12 泳道为精液DNA的阳性对照扩增结果，其余泳道为单精子扩增结果(2、17为Y精子，其余为 X精子)，ck为阴性对照；图4为从分离的Y精液中随机挖取单精子的PCR扩增产物检测结果，其中11、12 泳道为精液DNA的阳性对照扩增结果，其余泳道为单精子扩增结果(8、9为X精子，其余为 Y精子)，ck为阴性对照。上述4个图中，M均为Marker I，从下至上的条带依次为100bp、200bp、300bp、 400bp、500bp 和 600bp。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 以牛血液DNA和精液DNA为模板进行PCR扩增碱性裂解法制备牛基因组DNA需要碱性裂解液和中和液两个部分，碱性裂解液的 成分包括KOH 500mmol/L, DTT 125mmol/L ；中和液的成分包括Tris. HC1 900mmol/L, pH
=8. 3o各取公牛和母牛10 ii L抗凝血于0. 2mL高压灭菌PCR管中，加90 yl双蒸水，充分 混勻。12000rpm离心2-3分钟，弃去上层液体；对于公牛精液则取一支精液采用1ml 0. 25% 的蔗糖溶液，吸打混勻，12000rpm离心10分钟，可重复两次。向血液细胞或精子细胞中分别 加入lOiU碱性裂解液充分吸打混勻，65°C裂解10分钟，加入25iU中和液充分吸打混勻 立即用于PCR检测，或-20°C保存备用。引物设计依据GenBank中收录的性染色体上的牙釉基因序列(GI 29126030和GI 29126032，序列报道长度分别为6451bp和6264bp)，设计引物AML395，由上海英俊生物技术 有限公司合成，引物序列及相关信息见表1。表1引物AML395序列及相关信息
5引物代号
引物序列引物Tm值GC含量产物长度(°C)(%)长度F: TTCTCACCAGTACCCTTCCTA216247. 6395bp(Y)R TCAGAGGCAGGTCAGGAAGCA216861.9458bp(X)
AML395
PCR反应体系
采用25 yl反应体系，由以下几个部分组成(见表2) 表225 ill反应体系
元素用量终浓度ddH2010.9^1dNTP (lmmol/L)5(il0.2mMlOxPCR buffer1.5^10.6xPCR bufferPrimer AML 395 (2uM)2.5…180pMTaq (2.5U/(iL)0.6…1.5UDNA模板4|iil
伸 3min
扩增产物采用GoldViewna 〗荧光染料(灵敏度比EB高10倍左右)染色观察。 PCR反应条件94°C预变性3min，然后(94°C 1S，55°C IS)循环29次，最后72°C延
采用120V电压、2%琼脂糖凝胶电泳20min，凝胶成像系统检测分析，PCR结果如图 1所示。其中，bl-b8道为母牛血液PCR扩增结果，al-a4为公牛血液PCR扩增结果，cl-c4 泳道为公牛精液DNA的PCR扩增结果，ck为阴性对照，M为Marker I，从下至上的条带依次 为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。结果表明公牛血液和精液PCR产物均出现 了 395bp以及458bp条带，母牛血液PCR结果则仅有458bp产物条带。阴性对照均不存在 上述条带。说明本发明方法可信度高，不存在非特异性扩增。实施例2 单精子PCR扩增1、琼脂糖铺片分离单个精子1. 1使用蔗糖溶液(250mM蔗糖，5mM Tris.碱)洗涤精子a.取3支高压灭菌1. 5ml离心管。b.从液氮中分别取出常规精液、X精液、Y精液各一支，放入40°C水中瞬间解冻。c.用剪刀剪去细管棉塞一端，将剪去棉塞管口对准1.5ml离心管口，用剪刀剪去 另一端，精子顺管口流入1. 5ml离心管内，剩余精子用10 yl移液器吹入离心管内。d.将5 ill未稀释精子加入495 ill去离子水内，用移液器充分吸打混勻，取约 20 yl混勻精子铺满整个细胞计数板，在普通光学显微镜10倍镜下计数精子个数。e.将未稀释精液12000rpm离心10分钟，弃去上层液体后，加入lml蔗糖溶液充分 吸打混勻，12000rpm离心10分钟。f.弃去上层液体，加入lml ddH20洗涤精子，12000rpm离心10分钟，再弃去上层 液体，加入适量蔗糖溶液(调整精子为lX107mL)充分吸打混勻，-20°C保存备用。1.2分离单个精子
6
a.取0. lg低熔点琼脂糖溶于20ml ddH20，用微波炉加热制成0. 5%低熔点琼脂糖 溶液。b.低熔点琼脂糖溶液37°C左右时加入经洗涤并重悬精子1 Pi (约1000个精子) 充分吸打混勻。c.将混有精子的低熔点琼脂糖平铺于直径10cm培养皿。d.室温凝固后放入37 °C烘箱，烘干2小时。e.准备好放单精子高压灭菌0. 2ml PCR管，lml注射器改制的挖胶勺。f.将铺好平板放在倒置显微镜载物台上，在10倍或20倍镜下寻找单精子位置。g.使用自制挖胶勺挖取单个精子放入PCR管内，-20°C保存备用。2、单精子 PCR2. 1单精子裂解a.取出放有单精子的0. 2ml PCR管，3000g瞬时离心。b.向 PCR 管内加入 1 u 1 碱性裂解液(500mmol/L KOH, 125mmol/LDTT)，65°C裂解 10分钟，作为单精子PCR扩增的模板。注意精子中和液(900mmol/L Tris HC1，pH8. 3)加入总反应体系。2. 2 单精子 PCR本实验是利用单精子PCR对分离精液进行纯度鉴定，以公牛血液DNA作为阳性 对照，裂解的单精子作为模板。反应体系见表3，其中10XPCR buffer(500mM KClUOOmM Tris.HCl、0. 1 % 明胶)，采用 Eppendorf Mastercycler gradient PCR 仪(德国)进行 PCR反应。表 3元素体积使用浓度Lysis 溶液(500mmol/L KOH，1卩LLysis 溶液(20mmol/L125mmol/L DTT)KOH, 5mmol/L DTT)1 OX缓冲液1.5 iiL0.6XMgCl2(62.5mM)0.6 |aL1.5 mMdNTP (ImM)5 (0.L0.2 mMTris HCl(900mM)2.5^190mMAML395(2_2.5jiL180 pMddH2010.3 yLTaq 酶(2.5un_L)0.6 ^L模版1 ^iL总计25 pLPCR 反应条件:94°C 3min ； (94°C IS, 55°C IS)循环 29 次；72°C 3min。2. 3琼脂糖凝胶电泳a.琼脂糖凝胶制备取0.6g琼脂糖溶入30mL的0.8XTBE中，置电炉上加热并不 时摇动至完全熔化，室温冷至50 60°C，加4. 5 ii IGoldViewnaTMl荧光染料(灵敏度比EB 高10倍左右)立即摇勻，倒入电泳槽模具内，室温下放置20min以上，带凝胶凝固后拔出梳子。b. PCR产物上样电泳各取6iU PCR产物上样电泳，用DNAMarker I作为分子量 标准。120V电压电泳20min。c.结果检测常规精液、X精液、Y精液的单精子PCR结果分别见图2、3、4。其中， M 为 Marker I，从下至上的条带依次为 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp 和 600bp。图2为从常规精液中随机挖取单精子的PCR扩增产物检测结果，其中1-10道为单 精子扩增结果(1_3、6、9为X精子，4、5、7、8、10为Y精子)，CK为阴性对照；图3为从分离的X精液中随机挖取单精子的PCR扩增产物检测结果，其中11、12 泳道为阳性对照的扩增结果，其余泳道为单精子扩增结果(2、17为Y精子，其余为X精子)， ck为阴性对照；图4为从分离的Y精液中随机挖取单精子的PCR扩增产物检测结果，其中11、12泳 道为阳性对照的快扩增结果，其余泳道为单精子扩增结果(8、9为X精子，其余为Y精子)， ck为阴性对照。
8
按照上述方法、对样本中抽取的单精子进行检测，计算出X、Y单精子所占的比例， 从而判断该样本精子的分离纯度。
权利要求
一种检测牛单精子性别或牛分离精液中X、Y精子纯度的引物，其包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述引物在检测牛单精子性别中的应用。
3.权利要求1所述引物在检测牛分离X、Y精子纯度中的应用。
4.含有权利要求1所述引物的性别鉴定PCR试剂盒。
5.一种检测牛单精子性别的方法，其采用权利要求1所述引物或权利要求4所述试剂 盒对牛单个精子DNA进行PCR扩增，并检测其扩增产物，具有扩增产物长度为458bp的单精 子为X精子，具有扩增产物长度为395bp的单精子为Y精子。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，PCR反应条件为94°C预变性3min；然后94°C 1S，55°C 1S，循环 29 次；最后 72°C延伸 3min。
7.—种检测分离精液中X、Y精子纯度的方法，其采用权利要求1所述引物或权利要求 4所述试剂盒对分离精液中各个精子DNA进行PCR扩增，并检测其扩增产物，对检测结果进 行统计分析，判断分离精液中X、Y精子纯度。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，采用权利要求1所述引物或权利要求4所述 试剂盒进行扩增时，具有扩增产物长度为458bp的单精子为X精子，具有扩增产物长度为 395bp的单精子为Y精子。
9.如权利要求7或8所述方法，其特征在于，PCR反应条件为94°C预变性3min；然后 940C 1S，55°C 1S，循环 29 次；最后 72°C延伸 3min。 全文摘要
本发明涉及一种检测牛单精子性别或牛分离精液中X、Y精子纯度的引物及其应用。所述引物包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列，本发明利用上述引物采用快速PCR方法进行扩增检测，利用两个染色体特异扩增产物长度的差异通过琼脂糖凝胶电泳结果进行单个精子性别鉴定；通过对分离精液中分离的各单个牛精子进行简单PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，然后根据对单个精子性别检测结果的统计分析，对分离精子纯度做出最终评价。该方法在任意精子细胞中均能扩增出特异PCR产物，不需设计内标引物，是一种成本低廉，操作简便、快速、准确的鉴定牛X、Y精子分离纯度的技术，为后续性控精液的推广应用及精子分离方法的优化与创新提供了可靠、必要的技术支持。
文档编号C12Q1/68GK101935698SQ20101018276
公开日2011年1月5日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者吴承疆, 朱化彬, 杜卫华, 林博, 王栋, 程金华, 赵学明, 郝海生 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所