专利名称：玫瑰海棠试管花的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种观赏花卉玫瑰海棠试管花的培养方法，属于生物技术领域，具体地说是属于植物组织培养及试管成花技术范畴。
背景技术：
玫瑰海棠(Begonia mannii),别名丽格海棠，为秋海棠属的一种多年生常绿草本花卉，是近年从国外引进的新品种，为上世纪50年代荷兰育种家Peigen利用球根秋海棠 (Begonia tuberhybrida)与索科特拉海棠(Begonia socotrana)杂交育成的新品系。其株形极像球茎秋海棠，但无明显的球茎；其花色娇艳，花大色丽，具有玫瑰般的姿、色、香，因而被称为玫瑰海棠。其具有以下几大特点①花色娇嫩柔美、艳丽多彩(有紫红、大红、粉红、 黄、橙黄、白复色等)；②花朵繁密、花型多样(花瓣有单瓣、半重瓣、重瓣以及花瓣皱边等多种)、花姿优美；③其枝叶强壮，叶形美丽(心形)，叶色多样(绿色、棕色等)；④花期长达4-6 个月；⑤较耐荫，抗逆性强，适于室内观赏栽培，盆栽可用来点缀会议室、客厅、会客室、卧室、书房、阳台、橱窗等，小巧玲珑，雅致美观，窈窕妩媚，风姿卓越，也可装入艺术吊篮悬挂于室内观赏，艳丽华贵，别具一格。因此，其高价值的观赏性，使其经济价值提高，目前已成为世界著名的球根盆栽花卉之一。玫瑰海棠的研究主要集中于栽培、育种及组织培养方面。玫瑰海棠播种繁殖所需时间长，主要采用扦插或分株繁殖，但茎段扦插成活率低，分株繁殖速度慢，且易产生变异、品种退化，难以满足市场大量需求。而组织培养技术具有繁殖速度快，增殖倍数高，周期短，品种复状等特点，玫瑰海棠为草本花卉，且组织的再生能力很强，利用组培技术可以在短期内培育大量小植株，为生产上提供大量种苗，加快繁殖速度，提高经济效益。因此近年来，玫瑰海棠的组培快繁技术研究在国内外报道较多。这为玫瑰海棠种苗的规模化快速繁殖提供了一条可靠而有效的途径，克服了传统繁殖方法的不足。玫瑰海棠自引入我国后，很受欢迎，市场销量很好。但按照传统的栽培模式，玫瑰海棠的开花时间及花期仍然不够理想。玫瑰海棠性喜冷凉，生长适温在15°C 48°C，适合秋季扦插，春天即可开花。但春季的气温已渐升高，花不耐久放，市场接受度不大。若改为5-6 月份扦插，则花期刚好在冬末春初的元旦、春节开放，且花期大大延长。但5-6月，我国大部分地区气温已升高，怎样在自然条件下度过炎热夏季是栽培上的重点和难点。建空调温室要花费大量的财力或能源，也不理想。因此，如在传统的秋季栽培模式下，能利用简单的技术，对花期进行调控，使其提前开花，这无疑是一种很好的途径。而试管花的研究，刚好可以解决这一问题。试管成花，即在培养瓶内直接诱导开花，对于研究传统栽培模式下植物的开花机制、花期调控、试管育种等具有重要的指导意义，还可节约通过改变栽培环境如增建温室等来延长花期所耗费的能源。这是目前植物成花研究的一个新的领域及热点。试管成花，具有大田栽培无可比似的优点，如成花时间、花期可随意调控，不受季节影响，且实验周期短，而成熟的技术又可以直接用于大田生产。另外，如能培育出观赏价值很高的试管花，并能在室内进行大规模化的生产，它对于美化生活和工作环境、调节花期淡季、增加观赏花的新品种、新形式等将具有重要实践意义。试管花的研究在国外几年前就有报道，在我国近年才起步。但主要集中于兰花，如法国的Julien Costantin于1999年进行了兰科植物的试管开花研究，郑立明等于2005年对中国兰的试管开花进行了研究。玫瑰海棠试管内开花目前在国内外报道极少。玫瑰海棠在花色、花姿、花型及花期等上占有突出优势，很适合开发试管花。本发明旨在培育小型、精巧且具有高观赏价值的离体试管花，提高玫瑰海棠的观赏特性，创造更高的经济价值。为今后进行玫瑰海棠试管花的规模化生产提供技术依据，为其它高档花卉的观赏性精品试管花的生产提供借鉴，也为玫瑰海棠大田栽培条件下的花期调控提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种操作简单，周期短，生产成本低，具有高观赏价值的玫瑰海棠离体试管花的生产方法。本发明的技术方案，其步骤为
1.材料的选择选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片或芽(顶芽或侧芽)。2.外植体灭菌处理先从供试的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡 50-80s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用无菌水反复漂洗6_8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分；
3.丛芽的诱导
(1)叶片外植体将消毒后的叶片切成约l_2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面， 培养基为MS培养基，补充6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5 1. Omg/L,吲哚乙酸(IAA) 1. 5 2. Omg/L, PH值为5. 8 6. 0，10 12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，19 22 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至33 36天开始长出许多丛芽，培养条件为温度20-23°C，光照强度1500-2500Lux，光照时间5 8h/天。(2)芽外植体将消毒后的顶芽或侧芽，接种于诱导培养基，培养基为MS培养基， 补充 6-BA1. O 1. 5mg/L, IBA0. 1 0. 3mg/L, PH 值为 5. 8 6. 0，10 12 天芽开始生长， 约1个月形成34cm的丛生小苗。4.增殖培养将从外植体得到的丛芽或小苗在无菌操作的条件下进行继代增殖， 培养基为MS培养基，补充6-BA1.0 1.51^/1，吲哚丁酸(仍4)0.2 0. 5mg/L, PH值为 5. 8 6. 0，23 沈天，已长成3-km的小苗，并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9-12倍，培养条件为温度20-23°C，光照强度2000-2500LUX，光照时间10 12h/天。5.试管内成花培养待增殖培养基中的小苗，长至3-4 cm高，带4-5片小叶时， 轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0. 01 0. 03mg/L, IAAO. 1 0. 2mg/L,多效唑(MET)O. 1 0. 3mg/L, PH值为 5. 8 6. 0，培养 2 周时更换一次新鲜培养基，M 27天，顶芽分化出花蕾，33 36天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花1-3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为65 75%，培养条件为温度20-23°C， 光照强度2000-2500LUX，光照时间10 12h/天。
本发明的有益效果是直接利用玫瑰海棠叶片，增育出了小型精巧、花色丰富、形态多样，具有特殊观赏价值的玫瑰海棠试管花，其特点如下
(1)操作简单。利用几种成分简单的培养基，即可将叶子培养成丰富多彩的小花。本发明也试验了利用芽直接诱导丛生小芽的途径(芽一芽)，但是在生产上，如果大量取芽，会导致田间植株生长不良，或者要牺牲整个植株。取叶相对比较理想，不会太多影响植株。而且本发明利用叶片，采用附加6-BA及IAA的简单MS培养基，不需产生愈伤组织，直接从叶表面诱导出了小芽，这是非常理想的。因为如果先通过产生愈伤组织，再从组织块上分生小芽，通过了器官一细胞一器官的过程，在这个过程中可能会发生变异，难免保证原品种的优良特性。而且通过这条途径，愈伤组织往往需要经过继代培养，历时较长，不是最佳快速繁殖途径。这点也是本发明的创新点之一，目前尚未有资料报道通过这种叶一芽(器官一器官)的途径来获得新生芽的。(2)周期短。本发明从采摘田间叶片外植体，到获得无菌的丛生芽，通过增殖的健状无根小苗，直接诱导小型开花植株，整个过程大约需要100天左右，与田间的自然生长过程(从扦插小苗一大植株一开花，约需16-18个月)相比，明显缩短了生长周期。如果不经过外植体的诱导阶段，有现成的无菌小苗，只需1个月左右的时间即可生产出瓶花。而且本发明选用的增殖培养基配方，增殖倍数能达到9-12倍，也能明显地提高生产效率。(3)生产成本低。本发明的培养基配方中，只利用了四种简单的生长激素(6-BA、 IAA、IBA、MET)，就可以完成整个生产过程。而且这几种激素成本比较低，是组培中常规使用的试剂。这一点非常重要，否则关系到以后的生产规模及推广使用等问题。本发明所用的成花培养基，激素组合比较简单，而且首次在玫瑰海棠中创新地使用了 MET (多效唑)，而且成花效果还比较好。外植体是否能分化出花芽与植物的发育、营养及激素的种类和用量有着密切的关系，激素的种类和用量又起着决定性的作用。多效唑 (Paclobutrazol，又名 Multiple-Effect Triazole, MET)是 20 世纪 80 年代初发现的新型植物生长调节剂，对于提高植物抗逆性、促进成花和坐果、壮苗生根等具有重要作用，现已广泛应用于大田生产。多效唑在玫瑰海棠开花调节中的作用机理，还值得探讨。
具体实施例方式以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实例一
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡50s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒8min，最后用无菌水反复漂洗6次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。将消毒后的叶片切成约l-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS 培养基，补充6-BAO. 5mg/L, IAA1. 5mg/L，PH值为5. 8，10天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，19天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至35天开始长出许多丛芽，培养条件为温度22°C，光照强度2000LUX，光照时间6h/天。将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0mg/L，IBA0.;3mg/L，PH值为6. 0，23天，已长成3_4cm的小苗，并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9倍，培养条件为温度23°C，光照强度2500LUX，光照时间12h/天；
待增殖培养基中的小苗，长至3-4 c m高，带4-5片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0. 0lmg/L, IAAO. 2mg/L, METO. lmg/L, PH值为5. 8，培养2周时更换一次新鲜培养基，25天，顶芽分化出花蕾，35天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花2朵，花朵外观、色泽正常，成花率为75%，培养条件为温度23°C，光照强度2000LUX，光照时间Ilh/天。实例二
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡80s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒15min，最后用无菌水反复漂洗8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。将消毒后的叶片切成约l-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS 培养基，补充6-BA1. Omg/L, IAA2. Omg/L, PH值为6. 0，12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，20天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至33天开始长出许多丛芽，培养条件为温度21°C，光照强度1500LUX，光照时间8h/天。将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.5mg/L，IBA0.5mg/L，PH值为5. 8，洸天，已长成3_4cm的小苗，并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为12倍，培养条件为温度22°C，光照强度2000LUX，光照时间IOh/天；
待增殖培养基中的小苗，长至3-4 c m高，带4-5片小叶时，，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BAO. 03mg/L, I AAO. 2mg/L, METO. 3mg/L, PH值为5. 8，培养2周时更换一次新鲜培养基，27天，顶芽分化出花蕾，36天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为70%，培养条件为温度22°C，光照强度2500LUX，光照时间12h/天。实例三
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡60s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒lOmin，最后用无菌水反复漂洗7次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。将消毒后的叶片切成约l-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS 培养基，补充6-BAO. 8mg/L, IAA1. 8mg/L，PH值为5. 9，11天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，22天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至36天开始长出许多丛芽，培养条件为温度21°C，光照强度2500LUX，光照时间5h/天。将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-841.311^/1，1840.&^/1，？!1值为5.8，25天，已长成3_4cm的小苗，并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为11倍，培养条件为温度22°C，光照强度2000LUX，光照时间IOh/天。
待增殖培养基中的小苗，长至3-4 c m高，带4-5片小叶时，，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，养基为MS培养基，补充6-BA0.0aiig/L，IAAO. lmg/L, METO. 2mg/L, PH值为5. 8，培养2周时更换一次新鲜培养基，M天，顶芽分化出花蕾，33天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为73%，培养条件为温度22°C，光照强度2500LUX，光照时间12h/天。实例四
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠幼嫩的芽(顶芽或侧芽)；除去叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75%的酒精浸泡70s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒9min，最后用无菌水反复漂洗7次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。将消毒后的顶芽或侧芽，轻轻插入诱导培养基，培养基为MS培养基，补充 6-BA1. Omg/L, IBAO. :3mg/L，PH值为5. 8，10天芽开始生长，约1个月形成3_4cm的丛生小苗。 培养条件为温度22°C，光照强度2000LUX，光照时间12h/天。将从芽外植体得到的无菌小苗在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS 培养基，补充6-BA1. Omg/L, IBAO. 3mg/L, PH值为5. 8，25天，已长成3_4cm的小苗，并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为10倍，培养条件为温度 22°C，光照强度2200LUX，光照时间Ilh/天；
待增殖培养基中的小苗，长至3-4 c m高，带4-5片小叶时，，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BAO. 02mg/L, I AAO. 2mg/L, METO. lmg/L, PH值为5. 8，培养2周时更换一次新鲜培养基，25天，顶芽分化出花蕾，35天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花2朵，花朵外观、色泽正常，成花率为71%，培养条件为温度22°C，光照强度2500LUX，光照时间12h/天。
权利要求
1.一种玫瑰海棠试管花培养的方法，其特征在于采用玫瑰海棠叶片形成丛生芽的快速繁殖方法，在此基础上对其试管苗进行花芽诱导，它包括下列步骤(1)材料的选择选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；(2)外植体灭菌处理先从供试的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡50-80s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用无菌水反复漂洗6-8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分；(3)丛芽的诱导将消毒后的叶片切成约l-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面， 培养基为MS培养基，补充6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5 1. Omg/L,吲哚乙酸(IAA) 1. 5 2. Omg/L, PH值为5. 8 6. 0，10 12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，19 22 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至33 36天开始长出许多丛芽，培养条件为温度20-23°C，光照强度1500-2500LUX，光照时间5 8h/天；(4)增殖培养将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1. 0 1. 5mg/L,吲哚丁酸(IBA) 0. 2 0. 5mg/L, PH 值为 5. 8 6. 0， 23 沈天，已长成34cm的小苗，并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9-12倍，培养条件为温度20-23°C，光照强度2000-2500LUX，光照时间10 12h/ 天；(5)试管内成花培养待增殖培养基中的小苗，长至3-4c m高，带4-5片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0. 01 0. 03mg/L, IΑΑ0. 1 0. 2mg/L,多效唑(MET)O. 1 0. 3mg/L, PH值为 5. 8 6. 0，培养 2 周时更换一次新鲜培养基，24 27天，顶芽分化出花蕾，33 36天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花1-3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为70 75%，培养条件为温度20-23°C， 光照强度2000-2500LUX，光照时间10 12h/天。
2.根据权利要求1的玫瑰海棠试管花培养方法，其特征步骤(1)也可选用玫瑰海棠幼嫩的芽(顶芽或侧芽)；特征步骤(3)为将消毒后的顶芽或侧芽，接种于诱导培养基，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1. 0 1. 5mg/L, ΙΒΑ0. 1 0. 3mg/L, PH 值为 5. 8 6. 0，10 12天芽开始生长，约1个月形成34cm的丛生小苗，培养条件为温度20-23°C，光照强度 2000-2500LUX，光照时间11 12h/天；特征步骤(4)为将从芽外植体得到的小苗进行继代增殖，增殖培养基同上，培养条件同上。
全文摘要
本发明涉及一种玫瑰海棠试管花的培养方法，属于植物组织培养及试管开花技术领域。其特征是，以玫瑰海棠的成熟叶片作主要外植体，通过外植体消毒处理、丛生芽诱导、小苗生长与增殖、试管内成花培养等途径，成功地增育出了小型精巧、花色丰富、形态多样，具有特殊观赏价值的试管花。本发明操作简单，实验周期短，生产成本低，所生产的试管花，与传统栽培模式相比，花期可随意调控，不受季节影响，且节约了能源及场地，它对于美化生活和工作环境，调节花期淡季，增加观赏花的新品种、新形式，探索开花机理等将具有重要实践意义。玫瑰海棠因其在花色、花姿、花型及花期等上占有突出优势，很适合开发精品试管花，提高其观赏特性，创造更高的经济价值。
文档编号A01H4/00GK102217549SQ201110147710
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者不公告发明人 申请人:张曦予, 李宗菊