专利名称：龙脑樟树工厂化育苗方法
技术领域：
本发明涉及龙脑樟树工厂化育苗方法，具体是通过调整培养基和培养条件来提高育苗效率。
背景技术：
龙脑樟树叶是冰片的天然植物资源。樟树喜光，喜温暖湿润气候，对土壤要求不严，较耐水湿，但不耐干旱、瘠薄和盐碱土。由于早期对樟的开发利用多以提取精油为主，过度砍伐，对资源严重破坏，导致一些优良资源开始枯竭，加之市场需求不断扩增，因此，寻找一种有效的樟树繁殖方法具重要意义。目前樟树以种子繁殖为主，生产上出现种子发芽率低，成苗参差不齐且后代苗木变异较大等问题。利用组织培养，选取优良材料进行扩繁，不仅能快速繁殖生产苗木，且能保持母本的优良遗传性状。目前国内对于樟树组织培养的研究主要集中在无性快繁体系建立(邹晖，2009)、试管苗离体保存(吴金寿，2005)、以及玻璃化苗解决方法探索(魏琴， 2006)等方面，但各学者间的观点存在一定分歧，且全方面探讨指导樟工厂化生产的体系有待进一步完善；同时，现有龙脑樟组培技术中普遍存在增殖系数低，苗木易褐化且移栽存活率低等问题，长期制约着龙脑樟组培快繁的发展，因此因而需要进一步筛选优化配方，提高分化率和移苗成活率。
发明内容
本发明提供一种龙脑樟树工厂化育苗方法，可以解决现有龙脑樟组培技术中普遍存在增殖系数低，苗木易褐化且移栽存活率低等问题。为了实现上述目的，本发明的解决方案如下 龙脑樟树工厂化育苗方法，通过以下步骤实现
(1)外植体的采集采取前三天先喷洒多菌灵溶液进行预处理；选取龙脑含量高的优良单株，取主干下部幼嫩萌枝条作为外植体；
(2)无菌材料的获得枝条取下后用重量比0.1%的高锰酸钾溶液浸泡处理，饱和洗涤液浸泡处理，再用流水冲洗；再剪成带1-2个节间的茎段，用体积比75%乙醇溶液处理 ’然后用重量比0. 1%的升汞溶液浸泡处理，最后枝条经无菌水清洗后接种于芽诱导培养基上；
(3)无菌培养将获得的无菌材料在合适条件的光、温、培养基的管理下进行初代培养、 增殖培养和生根培养，促使树苗最大化生长；
(4)移栽将生根后的树苗转移至移栽大棚进行炼苗，5-10天后取出树苗，洗净根部培养基，用重量比0. 1%的高锰酸钾溶液浸泡处理，再清洗，沾取ABT生根粉，移栽入基质中，移栽后做好田间温湿度管理，达到符合生产用苗的标准。步骤(3)中初代培养是MS、6_BA (6_苄胺基嘌呤)和NAA (a-萘乙酸)的混合物， 其中6-BA和NAA按质量体积比计分别为2. 0 mg/L和0. 1 mg/L,其余成分为MS。增殖培养中采用两种不同的培养基交替使用。生根培养的培养基采用1/2改良MS、IBA(吲哚-3- 丁
3酸)和IAA (3-吲哚乙酸)的混合物，IBA和IAA按质量体积比计分别为0. 5 mg/L和0. 4 mg/L，其余成分为1/2改良MS，培养基中蔗糖浓度为20 g/L。改良MS培养基是将MS基本培养基中NH4NO3 (硝酸铵)浓度调为825 mg/L，其余组分浓度不变；1/2改良MS是将改良MS 中大量元素的含量降低一倍，其余组分含量不变。初代培养和增殖培养采用的培养基中含有卡拉胶6. 7 8/1，蔗糖3(^/1;生根培养采用的培养基中含有卡拉胶6.7 g/L，蔗糖20g/L; 初代培养、增殖培养和生根培养的培养基PH值均为5. 8-6. 0。上述培养条件采用光照时间12士2小时，光照强度2000-3500 lx，温度 25 士 2°C。步骤(4)中基质采用草炭珍珠岩为3:1。上述增殖培养采用的两种培养基均是改良MS、BA和NAA的混合物，其中改良MS是将MS中的NH4NO3浓度调为825 mg/L,其余组分浓度不变，两种增殖培养的不同在于BA和 NAA的质量体积比不同，其中一种培养基在以改良MS为基本培养基的前提下，每升添加BA 和NAA分别为2.0 mg和0.05 mg，另一培养基则是在以改良MS为基本培养基的前提下，每升添加BA禾口 NAA分别为1.0 mg禾口 0. 05 mg
本发明旨在选取龙脑含量高的优良单株，取其主干下部幼嫩萌枝作为外植体，建立组织培养技术体系，并运用于工厂化育苗生产。可运用本发明中的步骤建立一套完整的龙脑樟苗木工厂化生产规程，从而提高工厂化效率。本发明提出两种不同的增殖培养基交替使用，提高龙脑樟的增殖系数，同时不断不断筛选和完善龙脑樟组培的组织培养基、栽培基质和相应的培养和栽培参数解决龙脑樟组培过程中普遍存在的褐化问题，同时提高移栽存活率。
具体实施例方式1.外植体的采集
选取龙脑含量高的优良单株，取主干下部幼嫩萌枝作为外植体。采取前三天先喷洒800 倍多菌灵溶液进行预处理。2.无菌材料的获得
枝条取回室内用0. 1%高锰酸钾浸泡处理5 min，饱和洗涤液浸泡处理15 min，用流水冲洗30 min，置于操作台上，剪成带1-2个节间的茎段，75%乙醇处理15 s,0. 1%升汞浸泡处理10 min，无菌水清洗6遍，接种于芽诱导培养基上。3.无菌培养
初代培养:MS+BA2. 0 mg/L +NAAO. 1 mg/L，诱导率为 67% ；
增殖培养用改良 MS+BA2. 0 mg/L +NAAO. 05 mg/L 和改良 MS+BA1. 0 mg/L +NAAO. 05 mg/L交替使用，提高苗的增值率，苗长势好，增殖系数为5. 57 ；
生根培养最佳生根培养基为1/2改良MS+IBA0. 5 mg/L +ΙΑΑ0. 4 mg/L +蔗糖20 g/ L，生根率可达97. 33%，平均生根条数为5-6条，生根时间为12 d；
其中改良MS是将MS中的NH4NO3浓度降为825 mg/L ； 1/2改良MS是将改良MS中大量元素的含量减半，其余组分含量不变；初代培养和增殖培养采用的培养基中含有卡拉胶6. 7 g/L，蔗糖30g/L ；生根培养采用的培养基中含有卡拉胶6. 7 g/L，蔗糖20g/L ；初代培养、增殖培养和生根培养的培养基PH值均为5. 8-6. 0。
4
培养条件光照时间12士2小时，光照强度2000-3500 lx，温度25士2°C。4.移栽
将生根瓶苗转至移栽大棚进行炼苗，7d后将其从瓶中小心取出，洗净根部培养基，用 0. 1%高锰酸钾浸泡处理5 min，清洗，沾取25 mg/L ABT生根粉，移栽入基质中(草炭珍珠岩为3:1)，移栽后做好田间温湿度管理，30天后统计成活率。以草炭+珍珠岩(3:1)为移栽基质，成活率可达86. 11本发明开发出选出一套组培快繁技术体系的方法，可应用于龙脑樟组培苗工厂化生产。实施例1
选取龙脑含量高的优良单株，于3-4月、9-10月取主干下部幼嫩萌枝作为外植体。采取前三天先喷洒800倍多菌灵溶液进行预处理，枝条取回室内用0. 1%高锰酸钾浸泡处理 5 min，饱和洗涤液浸泡处理15 min，用流水冲洗30 min，置于操作台上，剪成带1_2个节间的茎段，75%乙醇处理15 s，0.1%升汞浸泡处理10 min，无菌水清洗6遍，接种于芽诱导培养基MS+BA2. 0 mg/L +NAAO· 1 mg/L上，培养条件光照时间12士2 h，光照强度2000-3500 lx，温度25士2°C，诱导率为67%，约30天后，待芽长至2cm左右，将其切下，再次转入芽诱导培养基(MS+BA2.0 mg/L +ΝΑΑ0. 1 mg/L)中继续诱导，培养条件光照时间12士2小时，光照强度2000-3500 lx，温度25士2°C，30天后诱导产生了不定丛芽，诱导率约97%。培养基添加卡拉胶6. 7 g/L，蔗糖30g/L，pH值5. 8-6. 0。实施例2:
增殖培养阶段，以改良MS附加激素BA 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，作预实验， 每处理10瓶，35天观察统计结果；在此基础上以改良MS附加BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)、 NAA (0. 00,0. 05,0. 1 mg/L)，开展L9 (34)正交试验，每处理10瓶，35天统计增殖系数及生长状况，重复3次。通过预实验得出在未添加激素的培养基上不定芽几乎不增殖，而激素BA能有效诱导不定芽增殖；在一定范围内(0-3.0 mg/L)随BA浓度增加，其增殖系数越高，随浓度继续增加0-5.0 mg/L)，增殖系数反而下降，且不同程度的出现畸形芽及玻璃化芽，说明高浓度BA在一定程度上抑制不定芽分化。将初代培养诱导产生的不定丛芽转入增殖培养基(改良MS+BA2. 0 mg/L +ΝΑΑ0. 05 mg/L)，培养条件光照时间12士2 h，光照强度2000-3500 lx，温度25士2°C。30天后观察 叶片颜色正常，苗木品质优良，增殖系数为5. 57。增殖的不定丛芽转入增殖培养基(改良 MS+BA1. 0 mg/L +ΝΑΑ0. 05 mg/L)，培养条件光照时间 12士2 h，光照强度 2000-3500 lx，温度25 士 2°C。30天后观察叶片颜色正常，苗木品质优良，增殖系数为4. 92。其中改良MS是将MS中的NH4NO3浓度降为825 mg/L,培养基添加卡拉胶6. 7 g/ L，蔗糖 30g/L，pH 值 5. 8-6.0。实施例3
不定芽增殖阶段试验筛选最佳培养条件，光照时间8、11、14 h，光照强度3000 lx，温度 25士2°C，筛选最佳光照时间；光照强度1500、20001x、3000 lx、35001x，光照时间11 h，温度 25士2°C，筛选最佳光照强度；温度20、25、观°C，光照时间11 h，光照强度3000 lx，筛选最
佳培养温度。每处理100瓶，重复3次，30 d后观察瓶苗生长状况。试验筛选得出最佳培养
5条件作为瓶苗生产阶段培养条件。实施例4
生根培养阶段，以1/2改良MS附加单一激素IBA(0. 2,0. 6,1. 0 mg/L)、NAA(0. 2、0· 6、 1.0 mg/L)、IAA(0. 2、0.6、1.0 mg/L)，作预实验，每处理100株，30 d统计生根率及根系生长情况；在此基础上以 1/2 改良 MS 附加 IBA(0. 5,0. 6,0. 7 mg/L)、IAA(0. 2、0· 4、0· 6 mg/L)作交互试验，每处理100株，30天统计生根率及根系生长情况，重复3次。通过预实验得出三种生长素NAA、IBA、IAA均能不同程度地诱导其生根，其中以激素IBA诱导效果最好，且浓度以0.6 mg/L为佳，约12天即可见基部出现白色根原基，浓度过低则生根率低，过高则会产生愈伤组织，不定根从愈伤组织长出，大大降低根质量；激素NAA使其产生愈伤组织，通过愈伤组织生根，生根率和不定根质量低；激素IAA处理生根所需时间偏长，约16 d可产生根原基，生根率亦较低。应用单一激素IBA诱导具较高生根率，但无次级根系产生，为了得到高质量根系，采取不同激素互作诱导，但激素NAA的使用会不同程度的诱导产生愈伤组织， 降低根系质量，故弃用。选取IBA、IAA进一步试验，根据生根率及有无愈伤组织形成，确定 IBA (0.5-0. 7)、IAA (0. 2-0. 4)激素使用浓度范围，筛选最佳诱导生根培养基。将2-3cm长的不定芽长，转接入生根诱导培养基(1/2改良MS+IBA0. 5 mg/L +IAA0.4 mg/L + 蔗糖20 g/L)，光照时间 12士2 h，光照强度20001x_3500 lx，温度25士2°C， 12天后观察到根系较粗壮，有少量侧根，5-6条，基部未出现愈伤，生根率可达97. 33%。改良MS是将MS中的NH4NO3浓度降为825 mg/L, 1/2改良MS是将改良MS中大量元素减半，其余组分浓度不变；培养基添加卡拉胶6. 7 g/L，蔗糖20g/L，pH值5. 8-6. 0。实施例5
将生根瓶苗转至移栽大棚进行炼苗，7天后将其从瓶中小心取出，洗净根部培养基，用 0. 1%高锰酸钾浸泡处理5 min，清洗，沾取25 mg/L ABT生根粉，移栽入基质中(草炭珍珠岩为3:1)，移栽后做好田间温湿度管理，30天后统计成活率。以草炭+珍珠岩(3:1)为移栽基质，成活率可达86. 11本发明旨在选取龙脑含量高的优良单株，取其主干下部幼嫩萌枝作为外植体，建立组织培养技术体系。可运用本发明中的步骤建立一套完整的龙脑樟苗木工厂化生产规程，从而提高工厂化效率。本发明提出两种不同的增殖培养基交替使用，提高龙脑樟的增殖系数，同时不断不断筛选和完善龙脑樟组培的组织培养基、栽培基质和相应的培养和栽培参数解决龙脑樟组培过程中普遍存在的褐化问题，同时提高移栽存活率。可以理解，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化，皆应视为不脱离本发明专利的范
权利要求
1.龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是通过以下步骤实现(1)外植体的采集选取龙脑含量高的优良单株，取主干下部幼嫩萌枝条作为外植体；(2)无菌材料的获得枝条取下后用重量比0.1%的高锰酸钾溶液浸泡处理，饱和洗涤液浸泡处理，再用流水冲洗；再剪成带1-2个节间的茎段，用体积比75%乙醇溶液处理；然后用重量比0. 1%的升汞溶液浸泡处理，最后枝条经无菌水清洗后接种于芽诱导培养基上；(3)无菌培养将获得的无菌材料在合适条件的光、温、培养基的管理下进行初代培养、 增殖培养和生根培养，促使树苗最大化生长；(4)移栽将生根后的树苗转移至移栽大棚进行炼苗，5-10天后取出树苗，洗净根部培养基，用重量比0. 1%的高锰酸钾溶液浸泡处理，再清洗，沾取ABT生根粉，移栽入基质中，移栽后做好田间温湿度管理，达到符合生产用苗的标准。
2.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(1)中采取主干下部幼嫩萌枝条三天前，先喷洒多菌灵溶液进行预处理。
3.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(3)中初代培养是 MS、6_苄胺基嘌呤和a_萘乙酸的混合物；其中6-苄胺基嘌呤和萘乙酸按质量体积比计分别为2. 0 mg/L和0. 1 mg/L，其余成分为MS。
4.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(3)增殖培养中采用两种不同的培养基交替使用。
5.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(3)中生根培养的培养基是1/2改良MS、吲哚-3- 丁酸和3-吲哚乙酸的混合物，吲哚-3- 丁酸和3-吲哚乙酸按质量体积比计分别为0.5 mg/L和0.4 mg/L，其余成分为1/2改良MS培养基，培养基中蔗糖浓度为20 g/L ；改良MS培养基是将MS基本培养基中NH4NO3浓度调为825 mg/L，其余组分浓度不变；1/2改良MS是将改良MS中大量元素减半，其余组分含量不变。
6.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(3)中，所述初代培养和增殖培养采用的培养基中含有卡拉胶6. 7 g/L，蔗糖30g/L ；所述生根培养采用的培养基中含有卡拉胶6. 7 g/L，蔗糖20g/L ；初代培养、增殖培养和生根培养的培养基pH值均为 5. 8-6. 0。
7.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(3)中的培养条件采用光照时间12士2小时，光照强度2000-3500 lx，温度25士2°C。
8.根据权利要求1所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是步骤(4)中基质采用草炭珍珠岩为3:1。
9.根据权利要求3所述的龙脑樟树工厂化育苗方法，其特征是所述增殖培养采用的两种培养基均是改良MS、6-苄胺基嘌呤和a_萘乙酸的混合物，交替使用。
10.其中改良MS是将MS中的NH4NO3浓度调为825mg/L,其余组分浓度不变，两种增殖培养的不同在于6-苄胺基嘌呤和a_萘乙酸的质量体积比不同，其中一种培养基在以改良 MS为基本培养的前提下，每升添加6-苄胺基嘌呤和a_萘乙酸分别为2. 0 mg和0. 05 mg ； 另一培养基则是在以改良MS为基本培养的前提下，每升添加6-苄胺基嘌呤和a_萘乙酸分别为 1. 0 mg 禾口 0. 05 mg。
全文摘要
本发明公开一种龙脑樟树工厂化育苗方法，通过以下步骤实现(1)外植体的采集；(2)无菌材料的获得；(3)无菌培养；(4)移栽。其中在无菌培养的增殖培养中采用两种不同的培养基交替使用。本发明选取龙脑含量高的优良单株，取其主干下部幼嫩萌枝作为外植体，建立组织培养技术体系，并运用于工厂化育苗生产，本发明提出两种不同的增殖培养基交替使用，提高龙脑樟的增殖系数，同时不断不断筛选和完善龙脑樟组培的组织培养基、栽培基质和相应的培养和栽培参数解决龙脑樟组培过程中普遍存在的褐化问题，同时提高移栽存活率。
文档编号A01H4/00GK102217548SQ201110147599
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者刘秀芳, 徐进芳, 曹冬萍, 林文革, 陈细萍 申请人:地缘(厦门)生物科技有限公司