专利名称：一种鱼类耳石荧光标记的方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类耳石荧光标记的方法。
背景技术：
鱼类的耳石是一种钙化组织，存在于内耳的膜迷路内，起平衡和听觉的组织，硬骨鱼类一般具有矢耳石、微耳石和星耳石3对耳石，分别存在于内耳的球囊、椭圆囊和听壶中。鱼类在与外界环境进行物质交换的过程中，环境中的化学元素不断被摄入鱼体，在鱼体内经过一系列的代谢、循环，最终会沉积到耳石上。因此，可通过改变鱼类生长的环境，使鱼类在耳石上形成特定的标记，以区别于自然种群。鱼类增殖放流效果评估通常采用标志重捕法，这就需要在放流前对鱼类进行标记来区分放流群体和野生群体。目前常用的标记方法有挂牌标记法、体外标记法、体内标记法、生物遥测技术四种，其中体外标记法包括切鳍法、烙印法、颜料注射法等，体内标记法包括编码金属标、被动整合雷达标、内藏可视标和化学标记法。耳石荧光标记属于化学标记法的一种，通常选用荧光染料，如茜素络合物和钙黄绿素等，因为它们可以与钙结合，并在耳石中沉积下来，在荧光显微镜下可检测到红色、绿色等荧光。该方法避免了其它标记方法对鱼体伤害较大，标记遗失率高，标记价格昂贵，保持率低、标记数量有限等缺点，且该方法适用于不同大小的鱼类群体，具有标记效率高，成本低，标记保留时间长等优点，是大规模鱼苗标记的理想手段，为人工放流种群识别和增殖放流效果评估等工作提供了新思路，具有较好的应用前景。目前，耳石荧光标记通常采用浸泡法，即把荧光染料溶解于水中，然后放入鱼苗饲养一段时间后取出，在鱼类耳石上将形成荧光标记环。最常用的荧光标记物是茜素络合物和盐酸四环素。但是研究表明，盐酸四环素溶液对鱼体有较大的毒性，浓度高时鱼类会出现不同程度的不适应或死亡，且标记效果较差，因此一般不作为推荐的荧光标记物，而茜素络合物为比较合适的荧光标记物。已有的研究报道表明一般用100mg/L以上的茜素络合物溶液浸泡之后才能在鱼类耳石上形成较为清晰的标记轮。如何春林等在《用荧光物质浸泡标记重口裂腹鱼仔鱼耳石》，四川动物2008年第3期，p331-314中所指出的，用荧光物质对重口裂腹鱼仔鱼浸泡标记表明，200 300mg/L的茜素络合物溶液浸泡12h对重口裂腹鱼仔鱼耳石有很好的标记效果，荧光和可见光下均能检测到明显的标记环；100 150mg/L的标记能检测到荧光标记环，但可见光下标记环较微弱。相同浸泡时间，随着浸泡浓度的增加， 耳石上标记环强度增加；相同浸泡浓度，随着浸泡时间的增加，耳石上标记环强度增加。三对耳石中，微耳石和矢耳石对茜素络合物较敏感，星耳石敏感性较低。盐酸四环素的标记效果很差，浸泡浓度为50 160mg/L时，三对耳石上均不能检测到标记环，同时110 160mg/ L的盐酸四环素浸泡液对仔鱼有较高的致昏或致死作用。因此，茜素络合物是对重口裂腹鱼鱼苗进行化学标记比较合适的荧光物质，而盐酸四环素不适合于标记该鱼的耳石。又如付自东等在《用荧光物质浸泡标记胭脂鱼仔、稚鱼耳石》所指出的，100 200mg / L的茜素络合物溶液浸泡24h对胭脂鱼仔、稚鱼耳石有很好的标记效果。
但根据物理性质可知茜素络合物微溶于水，需要使用其他助溶剂才可以达到可标记的浓度。而助溶剂的使用，对鱼类有着一定的副作用。因此，使用浸泡标记耳石的方法， 只有极少量的标记物会沉淀到耳石上，大部分标记物或存在于水中，无法得到利用，标记物的利用率极低，存在茜素络合物使用量大，浪费严重等问题，且会对环境造成一定的不良影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的鱼类耳石荧光标记的方法。 本发明所采取的技术方案是
一种鱼类耳石荧光标记的方法，包括以下步骤
1)将茜素络合物与鱼饲料混合均勻，使饲料中含有茜素络合物，得到标记饲料；
2)使用标记饲料喂养待标记鱼。优选的，使用标记饲料喂养待标记鱼的时间不短于24小时。优选的，茜素络合物的含量占标记饲料总质量的2% 10%。本发明的有益效果是
本发明方法避免了挂牌标记法和体外标记法对鱼体伤害较大且标记遗失率高的问题， 与编码金属标和被动整合雷达标等其它体内标记方法相比，标记价格低廉且适合大规模标记，与传统浸泡法进行耳石荧光标记相比更节约茜素络合物。本发明可根据待标记鱼种类、 大小以及数量，确定投喂标记饲料的量和时间，是一种可以普遍适用的标记方法。本发明方法中，茜素络合物被摄入鱼体内，几乎没有标记物分散至水体中，大大提高了标记物的利用率。这同时也降低了标记物对水体的潜在污染。
图1是广东鲂矢耳石在黄绿光、蓝光和紫光激发下的荧光图像；
图2是使用高茜素络合物含量饲料(1 10)喂养后，广东鲂微耳石在黄绿光、蓝光和紫光激发下的荧光图像；
图3是使用低茜素络合物含量饲料(1 40)喂养后，广东鲂微耳石在黄绿光、蓝光和紫光激发下的荧光图像。
具体实施例方式一种鱼类耳石荧光标记的方法，包括以下步骤
1)将茜素络合物与鱼饲料混合均勻，使饲料中含有茜素络合物，得到标记饲料；
2)使用标记饲料喂养待标记鱼。优选的，使用标记饲料喂养待标记鱼的时间不短于24小时。如果标记饲料中茜素络合物的含量高，可适当缩短喂养时间，反之，可适当延长。优选的，茜素络合物的含量占标记饲料总质量的2% 10%，即将茜素络合物与配合饲料按照质量比约为1:10 1:40的比例混合即可。下面结合实施例，进一步说明本发明。实施例11)选用茜素络合物作为荧光标记物，使其与鱼用配合饲料按照质量比1:10混合，加少量水，润湿饲料和茜素络合物，搅拌均勻，使得全部饲料呈紫红色，晾干，研磨制成适当颗粒大小的标记饲料；
2)投喂充足的标记饲料喂养广东鲂幼鱼24小时以上。标记结束，取出广东鲂幼鱼的耳石，用无水乙醇清洗耳石，去掉耳石表面杂质，在荧光显微镜下观察耳石，即可见如图1和图2的耳石标记轮。其中1均为黄绿光激发下观察图像；2均为蓝光激发下观察图像 ；3均为紫光激发下观察图像。实施例2
1)将茜素络合物与鱼饲料按1:40的比例混合，制成标记饲料；
2)投喂充足的标记饲料喂养广东鲂幼鱼24小时以上。标记结束，取出广东鲂幼鱼的耳石，用无水乙醇清洗耳石，去掉耳石表面杂质，在荧光显微镜下观察耳石，发现在微耳石上形成有清晰的标记轮。其结果如图3所示。其中 1为黄绿光激发下观察图像；2均为蓝光激发下观察图像；3均为紫光激发下观察图像。标记饲料
标记饲料，含有茜素络合物。优选的，为保证鱼的正常采食，茜素络合物占饲料的2 10%左右。可通过将茜素络合物与普通的鱼饲料，如各种商品饲料混合均勻得到。茜素络合物与鱼用配合饲料的比例可以根据待标记鱼的种类及其大小差异进行相应的调整。用于易标记的鱼类的标记饲料，茜素络合物的添加量可稍低；要标记的鱼越大，茜素络合物的添加量可稍高。为获得良好的标记效果，用标记饲料喂养待标记鱼的时间最好不少要24小时，为得到更加明显的标记轮，可延长用标记饲料喂养的时间。
权利要求
1.一种鱼类耳石荧光标记的方法，包括以下步骤1)将茜素络合物与鱼饲料混合均勻，使饲料中含有茜素络合物，得到标记饲料；2)使用标记饲料喂养待标记鱼。
2.根据权利要求1所述的一种鱼类耳石荧光标记的方法，其特征在于使用标记饲料喂养待标记鱼的时间不短于24小时。
3.根据权利要求1所述的一种鱼类耳石荧光标记的方法，其特征在于茜素络合物的含量占标记饲料总质量的2% 10%。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类耳石荧光标记的新方法。本发明将茜素络合物、鱼用配合饲料混合，制成标记饲料，然后喂养待标记鱼，从而可在标记鱼耳石上检测到可识别的荧光标记。它避免了其它标记方法对鱼体伤害较大，标记遗失率高，标记价格昂贵，保持率低，标记数量有限等缺点。该方法解决了通过浸泡进行耳石荧光标记方法中茜素络合指示剂的浪费和污染问题，是一种操作简单、费用低廉、易推广且适用于不同大小类型的鱼类耳石标记，特别适宜于进行大规模放流标记。
文档编号A01K61/00GK102273418SQ201110172710
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者吴茜, 李捷, 李新辉, 李跃飞, 杨计平, 王超, 谭细畅, 赖子尼 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所