专利名称：一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法
技术领域：
本发明涉及现代生物技术领域，确切地说是一种以子叶为外植体的黄连木植株高效再生方法。
背景技术：
黄连木是我国发展生物柴油产业首选的木本能源植物，在我国大部分地区均可生长和种植，适于在边际土地上生长。其种子含油率可达42.5%，出油率达20%-30%。以黄连木油为原料生产的生物柴油油质好。因此，黄连木被国家列为“十一五”期间重点开发的主要生物质能源树种，极具发展潜力。种子育苗是目前黄连木的主要育苗方法，然后进行移栽。由于黄连木属深休眠类型，必须进行低温沙藏100天以上和脱蜡处理等才能发芽。即便如此，其发芽率也在40%以下，而且种子是榨取生物柴油原料油的部位，利用种子直接发芽繁殖效率较低，而且对一些优良种质无法进行快速繁殖和推广，远不能满足对种苗的需求及黄连木产业的快速发展。 另外，由于没有一个高效的再生体系，使得黄连木在分子遗传改良方面处于一片空白。因此，急需开发一种黄连木高效再生的方法，以满足当前黄连木大量种苗的需求及分子遗传改良的需要。黄连木子叶再生是指从实生苗培养基上获得无菌苗，然后切取子叶，并沿胚轴中轴线纵切，将获得的两片子叶分别接种在子叶诱导培养基上，经过两周左右培养，切取幼芽接种在丛生芽增殖培养基上，可以诱导大量丛生芽，将每个诱导的丛生芽分开，分别诱导生根，从而可以获得大量的黄连木幼苗。目前通过胚轴、叶片等其它外植体进行快繁的效率极低，并且产生的后代植株容易产生变异。如采用子叶诱导的方式进行再生繁殖，不仅再生效率高、出现变异的几率极低，最为重要的是为黄连木进行分子遗传改良提供了技术支持。黄连木种苗的获得可以通过种子进行繁殖，但受季节的限制，通常黄连木种子的货架期为一年左右。秋季采摘的种子需要100天以上的低温沙藏及脱蜡处理来打破休眠才能发芽，而且种子的发芽率低，最高可达40%。同时由于黄连木组织内含有大量的多酚类次级代谢物，使得简单易行的扦插繁殖等方法的实施非常困难。另外，通过分子生物学手段对黄连木进行遗传改良也需要建立一种高效、快速的黄连木子叶再生方法。目前有关黄连木子叶再生的方法还未见报道，黄连木子叶再生的方法技术将为我国首选木本能源植物黄连木的快速繁殖和分子遗传改良提供技术支持，以打破有关该研究几乎空白的局面。
发明内容
本发明的目的是提供一种以子叶为外植体的黄连木植株高效再生方法，利用这种方法每个种子实生苗可以一次性获得4-8棵苗，且获得的再生苗变异率低。
上述目的通过以下方案实现
一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，其特征在于包括以下步骤A、将饱满的黄连木种子去掉外面硬种皮，经过消毒后进行漂洗，接种在实生苗生长培养基上，得黄连木无菌实生苗；
B、取生长12-18d的黄连木无菌实生苗，在无菌超净台内沿胚轴中轴线纵切以切取子叶，将获得的两片子叶分别接种在子叶诱导培养基上，培养12-16d后，得幼芽；
C、将幼芽切下转移至丛生芽增殖培养基，得诱导的丛生芽，然后将丛生芽切取转移至生根培养基，诱导生根，从而获得完整的黄连木植株；
所述的实生苗生长培养基是指=IADKW基本培养基，不添加任何激素；所述的子叶诱导培养基是指1/2WPM+DKW(WPM大量，DKW微量、有机及Fe-EDDHA) +6-BA2. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述丛生芽增殖培养基是指1/2WPM+DKW (WPM大量，DKW微量、有机及i^e-EDDHA) +6-BA3. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述的生根培养基是指1/2WPM+IBA1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L， pH=5. 8-6. O0一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，其特征在于步骤A所述的消毒是指在浓度为60%-80%的乙醇中浸泡0. 5-1. 5分钟，之后再在浓度为0. 05%-0. 15%的HgCl2浸泡6-10分钟，期间不停的摇动。一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，其特征在于步骤C所述的每个幼芽可诱导2-4个丛生芽。本发明的有益效果为
1、利用本发明进行再生繁殖不仅再生效率高，而且出现变异的几率极低；
2、利用本发明进行再生繁殖可以不必经过长时间的低温沙藏等打破休眠的处理，利用任何时期有活力的种子直接快速繁殖黄连木幼苗，从而节约了时间，避免了人力、财力、物力的过分集中使用和浪费，节约了时间，提高了有关育苗和相关实验的灵活性和机动性，而且繁殖效率大大提高，可以快速为黄连木能源林的建设提供充足的种苗；
3、本发明为黄连木的分子改良特别是转基因技术提供了很好的基础。目前通过胚轴、 叶片等其它外植体进行快繁的效率极低，并且产生的后代植株容易产生变异。
图1为实生苗生长培养基上的黄连木无菌实生苗示意图； 图2为接种在子叶诱导培养基的子叶示意图； 图3为诱导培养基上诱导出的幼芽示意图； 图4为丛生芽增殖培养基上诱导出的丛生芽示意图； 图5为转移至生根培养基的切取丛生芽示意图； 图6为生根培养基上长出根系的丛生芽示意图； 图7为移栽后长出的完整的再生植株示意图。
具体实施例方式参见图1-图7，一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，包括以下步骤
A、将饱满的黄连木种子去掉外面硬种皮，经过消毒后进行漂洗，接种在实生苗生长培养基上，得黄连木无菌实生苗；B、取生长15d的黄连木无菌实生苗，在无菌超净台内沿胚轴中轴线纵切以切取子叶， 将获得的两片子叶分别接种在子叶诱导培养基上，培养14d后，得幼芽；
C、将幼芽切下转移至丛生芽增殖培养基，得诱导的丛生芽，然后将丛生芽切取转移至生根培养基，长出3条健壮的根系健壮的根系，然后进行环境适应训练，最终长成一棵完整的再生植株；
所述的实生苗生长培养基是指=IADKW基本培养基，不添加任何激素；所述的子叶诱导培养基是指1/2WPM+DKW(WPM大量，DKW微量、有机及Fe-EDDHA) +6-BA2. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述丛生芽增殖培养基是指1/2WPM+DKW(WPM大量，DKW微量、有机及i^e-EDDHA) +6-BA3. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述的生根培养基是指1/2WPM+IBA1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L， pH=5. 8-6. O0所述的一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，步骤A所述的消毒是指在 70%的乙醇中浸泡1分钟，之后再用0. 1%的HgCl2浸泡8分钟，期间不停的摇动。所述的一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，步骤C所述小芽平均每个诱导3个丛生芽。
权利要求
1.一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，其特征在于包括以下步骤A、将饱满的黄连木种子去掉外面硬种皮，经过消毒后进行漂洗，接种在实生苗生长培养基上，得黄连木无菌实生苗；B、取生长12-18d的黄连木无菌实生苗，在无菌超净台内沿胚轴中轴线纵切以切取子叶，将获得的两片子叶分别接种在子叶诱导培养基上，培养12-16d后，得幼芽；C、将幼芽切下转移至丛生芽增殖培养基，得诱导的丛生芽，然后将丛生芽切取转移至生根培养基，诱导生根，从而获得完整的黄连木植株；所述的实生苗生长培养基是指1/2DKW基本培养基，不添加任何激素；所述的子叶诱导培养基是指l/2WPM+DKW+6-BA2. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+葡萄糖 20g/L+琼脂粉8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述丛生芽增殖培养基是指l/^WPM+DKW+e-BAS. Omg/ L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述的生根培养基是指1/2WPM+IBA1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 琼脂粉 8g/L， pH=5. 8-6. O0
2.根据权利要求1所述的一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，其特征在于 步骤A所述的消毒是指在浓度为60%-80%的乙醇中浸泡0. 5-1. 5分钟，之后再在浓度为 0. 05%-0· 15%的HgCl2浸泡6-10分钟，期间不停的摇动。
3.根据权利要求1所述的一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，其特征在于 步骤C所述的每个幼芽可诱导2-4个丛生芽。
全文摘要
本发明公开了一种以子叶为外植体的黄连木植株再生方法，将饱满的黄连木种子去掉外面硬种皮，经过消毒后进行漂洗，接种在实生苗生长培养基上，得黄连木无菌实生苗，再取生长12-18d的黄连木无菌实生苗，在无菌超净台内沿胚轴中轴线纵切以切取子叶，将获得的两片子叶分别接种在子叶诱导培养基上，培养12-16d后，得幼芽，将幼芽切下转移至丛生芽增殖培养基，得诱导的丛生芽，然后将丛生芽切取转移至生根培养基，诱导生根，从而获得完整的黄连木植株。利用本发明进行再生繁殖，不仅再生效率高、出现变异的几率极低，而且为黄连木进行分子遗传改良提供了技术支持。
文档编号A01H4/00GK102301959SQ20111023515
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日
发明者吴丽芳, 李明浩 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院