专利名称：一种实验动物肺脏病理固定方法
技术领域：
本发明涉及一种实验动物肺脏病理固定方法，属于生物技术领域。
背景技术：
动物实验是当前科学研究中最重要最常用的科学研究方法之一，是药理学、生理学、病理生理学等多种学科的基本研究手段。呼吸系统疾病(如C0PD、肺血管疾病、肺癌等) 是危害人类健康的重大疾病，因此呼吸疾病的研究是许多医学研究者重要的研究内容，呼吸疾病的动物模型已广泛用于呼吸系统疾病发病机理的研究及新药研发，其中实验动物的病理学结果是判断模型是否成功及科学研究的重要指标。实验动物肺脏的标准化病理处理对病理结果的准确性十分重要。肺脏具有较大的体积顺应性，呼吸时体积变化较大，另外肺体积与动物体重也有关系，理想的固定方法按吸气时肺的容积自然固定，这样有助于保存肺组织的自然形态。目前肺部的病理固定多采用福尔马林或4%多聚甲醛直接对离体动物肺脏进行浸泡固定，这种固定方法使肺体积急剧萎缩，压迫了肺泡和血管管腔，影响末梢支气管和血管病理变化的准确判断。另外还有研究者用注射器将固定液经气管注射到动物肺内，但这种方法常常因为施加压力过大，会破坏动物肺原有的组织形态，或因为肺脏不均勻充盈，影响实验结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作方便，成本低，固定快速，可规范化控制的实验动物肺脏病理固定方法，该方法可使动物肺脏得到充分均勻的自然灌注，有助于保存肺组织的自然形态，满足观察肺小血管、小气管病理变化的需要。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种实验动物肺脏病理固定方法， 其包括以下步骤
(1)灌注固定液将装有固定液的灌流容器悬挂于离体动物肺脏正上方，灌流容器连接的灌流管的液体流出端插入离体动物肺脏的气管中，利用固定液液面与动物肺脏所处水平面之间的高度差产生的静液压将固定液灌注入动物肺脏的肺泡中，使动物肺脏呈自然扩张的状态；
(2)浸泡固定液将所述步骤(1)得到的动物肺脏完全浸泡于固定液中进行固定。所述步骤(1)中固定液的体积等于实验动物肺容积，而通常实验动物的肺容积可以通过测定动物的肺功能而得。一般来说，灌注大鼠肺脏的固定液体积为ani，而灌注小鼠肺脏的固定液体积为0. 6ml。所述步骤(1)中以动物肺脏所处的水平面为基准，固定液液面所处的高度产生的静液压应能将等同于实验动物肺容积的固定液刚好灌入动物肺脏的肺泡内，且不会破坏肺组织。在本发明中，固定液液面与动物肺脏所处的水平面之间高度差(H)与固定液体积(V) 之间成正比关系H=10*V，其中高度差H的单位为cm，固定液体积V的单位为ml。通常，对于大鼠来说，固定液液面与动物肺脏所处的水平面之间的高度差为20cm ；而对于小鼠来说固定液液面与动物肺脏所处的水平面的高度差为6cm。所述步骤O)中的浸泡固定的时间为MtT48h。本发明所述的固定液采用以下质量百分比浓度的溶液4%甲酸、10%甲醛、4%多聚甲醛溶液或10%多聚甲醛溶液。本发明的有益效果如下
本发明实现了按照实验动物肺脏的容积进行自然固定，最大限度的保存肺组织的自然形态，可满足观察肺脏末端病理机构变化，可以达到清晰观察肺泡及肺末梢气管和血管形态的实验目的，避免了常规病理固定方法压迫了肺泡和血管管腔，影响末梢支气管和血管形态的弊端，且本方法方便易行，重复性好，成本低，固定快速，可规范化控制，便于标准化操作。可用于各种实验动物包括狗、兔子、大鼠、小鼠等不同实验动物的肺脏的病理固定，为实验动物肺组织的标准化固定提供了一种可靠稳定的实施方法。
图IA是未用本发明固定的大鼠肺脏的组织切片HE染色图。图IB是利用本发明固定的大鼠肺脏的组织切片HE染色图。图2A是未用本发明固定的小鼠肺脏的组织切片HE染色图。图2B是利用本发明固定的小鼠肺脏的组织切片HE染色图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行详细阐述，以说明本发明在实验动物肺脏固定的应用中的效果，但是以下实施例仅用于说明本发明的目的，并不限制本发明的保护范围。实施例一利用本发明固定大鼠肺脏组织进行病理切片观察肺组织形态材料及方法
一、主要实验材料
1、SPF级SD大鼠体重200g-250g，广东省实验动物中心
2、戊巴比妥钠广州化学二厂
3、多聚甲醛=Sigma公司
4、苏木素广州化学试剂二厂
5、伊红广州化学试剂二厂
二、主要仪器
1、Citadel1000组织脱水机英国Shandon公司
2、BM- II水浴式生物组织包埋机深圳新安毅达电子厂
3、光学显微镜日本Olympus公司
4、数码摄影一体化系统日本Nikon公司
5、荧光倒置显微镜德国Leica公司
三、实验方法
1.将装有2ml的4%(质量百分比浓度)多聚甲醛溶液的灌流容器悬挂于大鼠离体肺脏的正上方，其中，2ml的4%多聚甲醛溶液等于大鼠的肺容积。而4%的多聚甲醛溶液的液面与大鼠肺脏所在的水平面之间的高度距离20cm，此时，4%多聚甲醛溶液与动物肺脏之间的高度差产生的静液压能够将4%多聚甲醛溶液完全灌注入大鼠肺脏的肺泡中，且不会破坏肺组织。将灌流容器连接的灌流管的液体流出端插入大鼠肺脏的气管中并进行结扎，然后让2ml的4%多聚甲醛溶液在自身重力作用下向下自然均勻灌注至肺脏的肺泡中，使大鼠肺脏呈自然扩张的状态；然后将大鼠全肺完全浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定Mh。2.另外取一只大鼠的肺脏直接置于4%多聚甲醛溶液内进行固定Mh，作为对照， 取肺组织进行常规病理学切片处理，HE染色，显微镜下观察。病理标本的制备如下
将本发明固定好的大鼠肺组织和对照大鼠的肺组织置于4%多聚甲醛溶液固定Mh。1)脱水70%乙醇2h — 80%乙醇Ih — 95%乙醇Ih — 95%乙醇Ih —无水乙醇 2h —无水乙醇1. 5h —无水乙醇1. 5h
2)透明二甲苯0.5h — 二甲苯Ih — 二甲苯0. 5h
3)浸蜡低温(50°C)浸蜡Ih—浸蜡Ih
4)包埋浸蜡后的组织放入60°C石蜡中包埋
5)切片4um连续切片
6)摊片49°C温水中摊片
7)烘片55°C烘20min
8)透明和水化
二甲苯IOmin — 二甲苯IOmin —无水乙醇5min —无水乙醇5min — 95%乙醇5min — 80% 乙醇5min — 70%乙醇5min —流水冲洗IOmin
9)HE染色
苏木素染色Imin —流水冲洗Imin — 1%盐酸酒精脱色IOsec —流水冲洗IOmin —伊红染色IOsec —流水冲洗IOmin — 55°C烘20min —中性树胶封片
试验结果从图IA和图IB所示，采用本发明固定的大鼠肺组织经HE染色后，组织结构完整清晰，肺泡腔结构清楚，可见末梢的气血屏障结构，肺末梢的小动脉小静脉结构清晰，可见单层内皮细胞和平滑肌细胞层；采用现有的普通方法固定的对照大鼠肺组织经HE 染色后，肺末梢结构较清楚，肺泡较萎缩，肺泡腔不干净，无法识别肺内末梢的气血屏障结构，小血管染色后，结构不清楚，很难分辨内皮和平滑肌层。结论采用本发明固定的肺组织染色后切片，效果优于现有的普通固定方法，肺末梢结构清晰可见，肺泡结构清楚，肺泡腔干净，小血管结构清晰。实施例二
与实施例一不同的是采用小鼠的离体肺脏，固定液采用0. 6ml的4%(质量百分比浓度)甲醛溶液，4%甲醛溶液的液面与小鼠肺脏所在的水平面之间的高度距离6cm。小鼠全肺完全浸泡于4%甲醛溶液中进行固定48h。试验结果从图2A和图2B所示，采用本发明固定的小鼠肺组织经HE染色后，组织结构完整清晰，肺泡腔结构清楚，可见末梢的气血屏障结构，肺末梢的小动脉小静脉结构清晰，可见单层内皮细胞和平滑肌细胞层；采用现有的普通方法固定的小鼠肺组织经HE染色后，肺末梢结构较清楚，肺泡较萎缩，肺泡腔不干净，无法识别肺内末梢的气血屏障结构，小血管染色后，结构不清楚，很难分辨内皮和平滑肌层。结论采用本发明固定的小鼠肺组织染色后切片，效果优于现有的普通固定方法，
5肺末梢结构清晰可见，肺泡结构清楚，肺泡腔干净，小血管结构清晰。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不是限制，如不限于实施例所列举的固定液，采用以下质量百分比浓度的溶液10%甲醛10%多聚甲醛溶液也是可以的；全肺的浸泡固定时间在内也可以实现本发明的目的；而固定液液面与离体动物肺脏所处的水平面高度差根据H=10*V计算，其中高度差H的单位为cm，固定液体积V的单位为ml，而固定液体积V根据实验动物的肺容积来确定。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种实验动物肺脏病理固定方法，其特征在于，其包括以下步骤(1)灌注固定液将装有固定液的灌流容器悬挂于离体动物肺脏正上方，灌流容器连接的灌流管的液体流出端插入离体动物肺脏的气管中，利用固定液液面与动物肺脏所处水平面之间的高度差产生的静液压将固定液灌注入动物肺脏的肺泡中，使动物肺脏呈自然扩张的状态；(2)浸泡固定液将所述步骤(1)得到的动物肺脏完全浸泡于固定液中进行固定。
2.根据权利要求1所述的实验动物肺脏病理固定方法，其特征在于，所述步骤(1)中固定液体积等于实验动物肺容积。
3.根据权利要求1所述的实验动物肺脏病理固定方法，其特征在于，所述步骤(1)中静液压能将等同于实验动物肺容积的固定液灌入动物肺脏内。
4.根据权利要求1所述的实验动物肺脏病理固定方法，其特征在于，所述步骤(1)中固定液液面与动物肺脏所处的水平面之间高度差与固定液体积之间成正比关系H=10*V，其中H为固定液液面与动物肺脏所处的水平面之间高度差，单位为cm，V为固定液体积，单位为ml。
5.根据权利要求1所述的实验动物肺脏病理固定方法，其特征在于，所述步骤(2)中的浸泡固定的时间为MtT48h。
6.根据权利要求1所述的实验动物肺脏病理固定方法，其特征在于，所述的固定液采用以下质量百分比浓度的溶液4%甲酸、10%甲醛、4%多聚甲醛溶液或10%多聚甲醛溶液。
全文摘要
本发明公开了一种实验动物肺脏病理固定方法，其包括以下步骤(1)灌注固定液将装有固定液的灌流容器悬挂于离体动物肺脏正上方，灌流容器连接的灌流管的液体流出端插入离体动物肺脏的气管中，利用固定液液面与动物肺脏所处水平面之间的高度差产生的静液压将固定液灌注入动物肺脏的肺泡中，使动物肺脏呈自然扩张的状态；(2)浸泡固定液将所述步骤(1)得到的动物肺脏完全浸泡于固定液中进行固定。本发明操作方便，成本低，固定快速，可规范化控制可使动物肺脏得到充分均匀的自然灌注，有助于保存肺组织的自然形态，满足观察肺小血管、小气管病理变化的需要。
文档编号A01N1/00GK102435476SQ20111026366
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者云昕, 卢文菊, 林纯意, 江倩, 王健, 陈豫钦 申请人:呼吸疾病国家重点实验室, 广州医学院第一附属医院