专利名称：玉米铁氧还蛋白的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米铁氧还蛋白的新用途。
背景技术：
玉米矮花叶病可由一至多种病毒系统性侵染引起，在全世界范围内造成严重的经济损失。国际上已报道的可引起玉米矮花叶病的病毒有6种，均属于马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)，它们分别是甘蔗花叶病毒(Sugar cane mosaic virus，SCMV)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高梁花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV) > ^11 ^ ^^ (Johnsongrass mosaic virus, JGMV)^ (Zea mosaic virus,ZeMV)和白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)。在我国，甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)是引起北方玉米产区玉米矮花叶病的优势株系(Fan Z F，Chen H， Liang X,and Li H F. Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China. Arch Virol，2003，148 :773-782.)。作为专性寄生物的植物病毒，其生活史的完成必须依赖寄主因子参与病毒脱壳、 基因组复制、病毒颗粒组装和病毒运动过程。如Wittmann等(Wittmann S，Chatel H， Fortin M G. et al. Interaction of the Viral Protein Genome Linked of Turnip Mosaic Potyvirus with the Translational Eukaryotic Initiation Factor(iso)4E of Arabidopsis thaliana Using the Yeast Two-Hybrid System. Virology,1997, 234(1) :84-92.)禾口 Leonard 等(Leonard S, Plante D, Wittmann S, et al. Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity. J. Virol. ,2000,74(17) :7730-7737.)的实验结果表明，芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)的基因组连锁蛋白(virus genome-linked protein, VPg)可能通过与真核细胞起始因子(eukaryotic initiation factor 4E)的相互作用而实现病毒相关蛋白的合成，指出这种互作是病毒制造(virus production)的关键兀件。Dunoyer 等(Dunoyer P，Thomas C，Harrison S，et al. A cysteine—rich plant protein potentiates Potyvirus movement through an interaction with the virus genome-linked protein VPg. J. Virol.，2004，78(5) M01-2309.)利用酵母双杂交发现Mtyvirus的Vi^g与植物中一个命名为PVIP蛋白相互作用，且PVIP支持该病毒在植物体内的运动。OTb蛋白是Mtyvirus基因组编码的依赖RNA的 RNA 复制酶(RdRp)，Wang 等(Wang X，Ullah Z，Grumet R. Interaction between zucchini yellow mosaic potyvirus RNA-dependent RNA polymerase and host poly (A)binding protein.Virology,2000, 275(2) :433-443.)和 Dufresne 等(Dufresne P J, Thivierge K，Cotton S，etal. Heat shock' 70 protein interaction with Turnip mosaic virus RNA-dependent RNApolymerase within virus-induced membrane vesicles. Virology, 2008,374(1) :217-227.)分别用串联亲和纯化方法和酵母双杂交等方法，发现黄瓜和拟南芥的poly(A)结合蛋白与OTb互作，表明poly(A)结合蛋白在病毒复制中起重要作用。HC-Pro是Potyvirus病毒基因组编码的第2个蛋白，是一个重要的多功能蛋白。近年来的研究表明，该蛋白具有蛋白酶和辅助蚜虫传毒活性、参与病毒基因组复制和病毒移动、干扰微RNA(miRNA)途径、参与病毒病症状表达等，特别是该蛋白具有抑制植物基因沉默功能， 是该病毒的致病因子。铁氧还蛋白(ferredoxin，Fd)是植物叶绿体中PSI的重要组成部分，介导光合电子传递。像其它大多数叶绿体蛋白一样，Fd也是由核基因编码，在细胞质中合成前体蛋白， 然后通过其N端的前导肽(transit peptide)介导蛋白前体在翻译后运送到叶绿体中。作为C4植物的玉米具有两种光合细胞，即维管束鞘细胞(the bundle-sheath cell, BSC)和叶肉细胞(mesophyll cell, MC) 0至今已发现玉米有六种Fd包括三种光合型Fd(Fd I、Fd II和Fd V)和3种非光合型Fd(Fd III,Fd IV和Fd VI)。光合型Fd II、Fd V主要在BSC 中表达，参与PS I中的高活性循环电子传递(cyclic electron flow，CEF)，产生额外的ATP 供Calvin cycle和CO2浓缩机制所需；同时Fd V传递能力明显高于Fd II。而CEF对于增强玉米植物的耐寒性(Ducruet J M, Roman Μ,Havaux Μ, et al. Cyclic electron flow around PSI monitored by afterglow luminescence in leaves ofmaize inbred lines (Zea mays L.) !correlation with chilling tolerance. Planta,2005,221 (4) :567-579.)、保护光系统 II(photosystem II，PS II)免受光抑制(Rumeau D, Peltier G, and Cournac L. Chlororespiration and cyclic electron flow around PSI duringphotosynthesis and plant stress response. Plant Cell Environ.，2007，30 (9) : 1041-1051)和其它协迫的伤害等关系密切；低活性的CEF可导致植株生长受抑、叶绿体含量降低、易受到光漂白等(Kimata-Ariga Y, Matsumura T, Kada S, et al. Differential electron flow around photosystem I by two C(4)-photosynthetic-cell-specific ferredoxins. EMBO J., 2000，19(19) :5041-5050.)。
发明内容
本发明的一个目的是提供铁氧还蛋白V在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用。所述铁氧还蛋白V的氨基酸序列为序列表中序列1所示。本发明的另一个目的是提供序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。所述花叶病毒为甘蔗花叶病毒。所述抑制花叶病毒复制为抑制花叶病毒在植物原生质体中的复制。所述植物为玉米。
本发明通过在玉米原生质体中共转化能表达Fd V的质粒与SCMV RNA，超量表达 Fd V可将SCMV病毒复制水平降低约40%，表明超量表达Fd V可有效抑制SCMV复制。这将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用，同时为玉米的分子育种打下良好的基础。
图1为质粒pGFP-Fd V酶切验证结果。图2为超量表达FdV对SCMV病毒复制水平的影响。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施案例1、过量表达铁氧还蛋白V(FdV)抑制甘蔗花叶病毒(SCMV)的复制一、构建 FdV 表达载体(pGFP-FdV)按照分子克隆常规方法，构建pGFP-FdV。具体方法如下以载体pGAD_FdV (公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是Cheng YQ, Liu ZM, Xu J，Zhou Τ, Wang Μ, Chen YT, Li HF and Fan ZF(2008). HC-Pro protein of Sugarcane mosaicvirus specifically interacts with maize ferredoxin_5in vitro and in planta. J. Gen. Virol. 84(7) :2046-2054)为模板，用上下游引物上游引物5'-ATAGAGCTCAATGGCCACCGTCCTGAGC-3 ‘(下划线部分为 Sac I 酶切位点)，下游引物5'-GGCGTCGACTTTAGGAGATAAGGTCATCCT-3 (下划线部分为 I 酶切位点)，扩增得到FdV蛋白的编码基因序列，该编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2 所示，该序列所编码的FdV蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。用Ml I和Mc I 酶切该编码基因序列和载体PGFP (公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是Shi Y, Qin YH, Cao YY, Sun H, Zhou Τ, Hong YG and Fan ZF(2011), Influence of an m-type thioredoxin in maize on potyviral infection. Eur. J. Plant Pathol. 131 317-326)；按照使用说明，用DNA胶回收试剂盒(购自AXYGEN公司)回收纯化酶切后的基因片段和载体大片段。连接回收纯化后的载体大片段与基因片段，并将连接物转入大肠杆菌DH5ci感受态细胞，后将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。将重组质粒进行酶切验证，检测结果见图1 (图1中泳道M为DNA分子量标准；泳道1为pGFP-Fd V酶切产物)，从图1可见，酶切得到了约420bp大小的片段，与预期结果一致，证明质粒构建正确，将得到重组质粒命名为PGFP-Fd V。二、甘蔗花叶病毒(SCMV)的RNA提取在玉米品种综31 (公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是 Cheng YQ,Liu ZM,Xu J，Zhou Τ,Wang Μ,Chen YT,Li HF and Fan ZF(2008). HC-Proprotein of Sugarcane mosaic virus specifically interacts with maize ferredoxin_5in vitro andin planta. J. Gen. Virol. 84(7) :2046-2054)第 3 片叶上摩擦接种甘蔗花叶病毒 (SCMV)(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是Cheng YQ, Liu ZM,Xu J,Zhou T, Wang M,Chen YT,Li HF and Fan ZF (2008). HC-Pro protein of Sugarcane mosaicvirus specifically interacts with maize ferredoxin_5in vitro and in planta. J. Gen. Virol. 84(7) :2046-2054)，24°C 生长 10-12 天后，取其由病毒侵染而导致呈花叶症状(即不均勻褪绿而形成花叶、条纹等)的叶片200g，剪成小段，在液氮中研磨成粉状。在研磨后的粉状物中加入400ml提取缓冲液I〔0. 5M磷酸钾缓冲液，使用前加入0. OlM 的DIECA ( 二乙基二硫代氨钾酸钠，铜试剂)和1 % 2-ME (2-巯基乙醇，V/V，pH 7.2)),室温下搅拌均勻。用单层尼龙纱过滤，滤液加20% (V/V)CC14，充分搅拌20-30min。8，500rpm离心25min。往上清液中加入0. 25M的NaCl (终浓度)，搅拌至完全溶解后，再加入PEG 6000， 使其终浓度为6g/L，，冰浴中搅拌至PEG完全溶解，于4°C静置池。8，500rpm离心30min， 沉淀用含I^iTriton的提取缓冲液11(0. 05M磷酸钾缓冲液，pH 7.2)于4°C悬浮过夜。 7，OOOrpm离心15min，将上清液置于20%的蔗糖垫上，38，OOOrpm离心90min。沉淀用1. Oml 提取缓冲液III(0.005M磷酸钾缓冲液，pH 7. 2)充分悬浮，4°C冰箱中过夜。7，OOOrpm离心 IOmin去沉淀，上清液即为粗提纯的病毒，然后以100 μ 1为单位分装，于_80°C冰箱中保存往100 μ 1病毒中加入160 μ 1 DEPC处理的ddH20,再加入200 μ 1 RNA抽提缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 8.0 ；200mM NaCl ；5mM EDTA)，然后加入 40 μ 1 10% SDS，混勻，室温保持5min。加入800μ 1的PCI(苯酚氯仿异戊醇=25 24 1)，混勻，12000 X g离心 5min。吸取上层水相，加入2倍体积的PCI，混勻，12000g离心5min，再重复抽提一次。吸取上层水相，确定其体积后，加入1/10 (V/V) 3M的NaAC (pH 5. 2)，混勻；加入2. 2倍体积的无水乙醇，混勻，_80°C沉淀Ih或-20°C沉淀过夜。12000Xg离心20min，用Iml 70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥；所得RNA溶于30 μ 1 DEPC处理的ddH20中，_20°C保存备用。三、玉米原生质体的分离和转化将玉米品种郑58(购自河南省农业科学院)种子吸涨后置于25°C的培养箱中发芽、暗培养。当玉米黄化苗长到第2片叶高于第1片10-15cm时，剪下第2片叶子中间的 6-8cm的部分，轻轻将20片剪下的叶片叠在一起，切成0. 5mm的细丝，放入盛有30ml酶溶液 (0. 6M mannitolUOmM MES pH5. 7、ImM CaCl2>5mM β -mercaptoethanoUO. 1% BSA、0. 3% Macerozyme R-10和1· 5% Cellulase R-10)的带侧壁的烧瓶中消化。将盛有酶溶液的烧瓶抽真空30min，使酶溶液充分渗透到叶片中。然后在25°C摇床(40rpm)中继续消化池， 然后再用SOrpm消化5min。将含有原生质体的酶溶液滤过35 μ m的尼龙网，转移到底部是圆形的离心管里，150g离心aiiin，将原生质体沉淀下来。用电击缓冲液(0.6M mannitol, 4mM MES, pH5. 7，and 20mM KCl)洗1-2次。150g离心2min，小心吸去上清液，用电击缓冲液重悬原生质体，用血球计数板计数使重悬后的原生质体浓度达到lX105/ml-2X105/ml， 将原生质体置冰上备用。在2ml圆底离心管中加入25 μ g重组质粒pGFP-Fd V(由步骤一制备得到)和300 μ 1原生质体，再加入5 μ g SCMV RNA (由步骤二得到)，枪吸混勻，电击2 次(5msec, 200uF, 400V)，冰上放置IOmin0 150g离心2min,吸去上清液，用Iml孵育缓冲液 (0. 6M mannitol、4mM MES pH5. 7和4mM KCl)重悬原生质体，25°C黑暗孵育过夜。同时设对照原生质体(m)，即在原生体中共转化空载体pGFP和SCMV RNA。四、提取转化后的玉米原生质体总RNA和Real-time RT-PCR检测将Iml的Trizol(北京博迈德科技发展有限公司产品)加入到步骤三的原生质体中，剧烈振荡3min ；冰上放置5min。勻浆用台式冷冻离心机于4°C、12，OOOg条件下离心 IOmin以除去不溶的成分，将上清转入一新的1. 5ml离心管中。在室温下静置5min，加0. 2ml 氯仿，剧烈震荡15s，然后在室温下静置2-5min，再于4°C、12，000 X g的条件下离心15min。 将上层水相转移到新的1. 5ml离心管中，加0. 5ml异丙醇，混合(上下颠倒)，使样品在室温下静置15min，4°C、12，000Xg离心lOmin，则RNA会在管的侧壁和底部形成沉淀。弃上清，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4°C、7，500 Xg离心5min (如RNA沉淀悬浮起来，则用 12，000 X g)，弃乙醇，获得原生质体总RNA。将得到的总RNA在室温下干燥IOmin或在冷冻离心浓缩机上浓缩5min，然后加入30 μ 1 DEPC处理的超纯水溶解，_70°C保存备用。将上述得到的总RNA用DNase I消解后，在紫外分光光度计上分别测定其在230、260和^Onm的吸光值以确定其纯度和浓度。用试剂盒Takaka SYBR premix Ex. TaqTm(Takaka公司产品)进行Real-time RT-PCR分析超量表达FdV对SCMV复制的影响。 以500ng总RNA作为模板，以试剂盒自带Oligo-d(T)和Random 6 mers作为反向引物，进行 RT 反应。每个反应管依次加入4· 0μ 1 5 X Reaction Buffer, 1. 0μ 1 dNTPs (IOmM)、0· 5 μ 1 RNase inhibitor^. 5 μ 1 01igo-d (T) Primer (50 μ Μ) >0. 5μ 1 Random 6mers (100 μ Μ)、 500ng 总 RNA、0· 5 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase，最后用 DEPC H2O 补充至 20 μ 1。反应液在42 °C水浴反应Ih。每个PCR反应管中加入1. 0 μ 1用稀释缓冲液(EASY Dilution)稀释10倍的RT 产物、10μ1 SYBR Green,0. 4μ 1 Dyell、正反向引物各 0. 2 μ 1、最后加 8. 2 μ 1 dd H2O 补充至20μ1。在ABI公司生产的荧光定量PCR-ABI7500扩增仪进行反应。反应条件是95°C， 30s ；95°C, 5s ；58°C, 20s ；72°C,35s ；40 个循环。Real time PCR 结束以后，根据扩增仪自带的软件对数据进行分析。检测Fd VmRNA的弓丨物如下正向引物5，-ACTACCGTGGCCATGACCCGTG-3，；反向引物5，-CCTCGGCGTAGTCCAGGATGTAG-3，。检测SCMV mRNA的引物如下正向引物5，-GGCGAGACTCAGGAGAATACA-3，；
反向引物5，-ACACGCTACACCAGAAGACACT-3，。 实验结果见图2，其中A图显示Fd V mRNA水平；其中Fd和m分别表示共转化 pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生质体、共转化空载体pGFP和SCMV RNA的原生质体中的Fd V mRNA水平；B图显示SCMV RNA水平；其中Fd和m分别表示为共转化pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生质体、共转化空载体pGFP和SCMV RNA的原生质体中的SCMV RNA水平。从A图可见，与对照相比，转入pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生质体中Fd V mRNA水平显著增加，表明Fd V已得到超量表达；从B图可见，与对照相比，转入pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生质体中SCMV RNA水平显著下降，降幅为40%，这说明过量表达Fd V能有效抑制SCMV的复制。
权利要求
1.铁氧还蛋白V在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述铁氧还蛋白V的氨基酸序列为序列表中序列1所示。
3.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用； 所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
4.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于所述花叶病毒为甘蔗花叶病毒。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于所述抑制花叶病毒复制为抑制花叶病毒在植物原生质体中的复制。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为玉米。
全文摘要
本发明公开了玉米铁氧还蛋白的新用途。本发明所提供的新用途为铁氧还蛋白V在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用、序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用、以及含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制花叶病毒复制的产品中的应用。本发明通过在玉米原生质体中共转化能表达Fd V的质粒与SCMV RNA，超量表达Fd V可将SCMV病毒复制水平降低约40％，表明超量表达Fd V可有效抑制SCMV复制。这将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用，同时为玉米的分子育种打下良好的基础。
文档编号A01N47/44GK102379305SQ201110300058
公开日2012年3月21日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者王仲, 王克双, 程玉琴, 范在丰 申请人:中国农业大学