专利名称：转基因动物重组产物精确分析检验方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及转基因哺乳动物生物安全评价及外源基因功效评定，应用本发明可精确评价转基因动物的生物学特性、转基因动物与同品种非转基因动物的生物学特性比较，以及转基因动物产品与非转基因动物产品之间的差异，从而能客观、正确、精确地对转基因动物产品作出生物安全性评价。
背景技术：
根据目前的报道，对转基因哺乳动物及转基因动物产品都是用同种动物的不同个体作为对照，从而比较两者的差异或优劣，作出转基因动物或其产品的安全性评价及功效分析。由于动物之间的个体差异，这种比较和评价会出现较明显的误差，或者由于个体差异使评价和分析没有结果。同一细胞系制备的克隆动物具有相同的染色体遗传，并且具有相同的表型。目前，通常的转基因生物安全性评价只是将转基因动物与同品种的非转基因动物比较，由于动物个体的差异，其评价结果误差较大，并且难以对核酸、蛋白质进行精确分析和比较。应用本发明技术可更加精确、可靠地评判转基因动物生物效应及其产品的生物安全性评价。
发明内容
转基因动物研究开发过程中必需对其导入某种特性(性状)进行精确分析和检验，确定其生物学功能、对宿主动物的生理生化影响、及非转基因产品与转基因产品对人类的影响作比较分析。但是，由于动物个体差异及多态性，会给这些分析带来误差，甚至难以鉴定出结果，从而不能对转基因哺乳动物进行精确分析和测定，从而影响转基因动物生物安全性评价。为了解决上述问题，本发明提供了一种转基因动物重组产物精确分析检验方法，该方法应用体细胞克隆技术，制备遗传背景相同的转基因和非转基因动物。其技术环节包括细胞培养、细胞转基因、体细胞克隆(体细胞核移植，SCNT)、蛋白质和核酸分析。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种转基因动物重组产物精确分析检验方法，包括以下步骤(1)采集一个动物的体细胞(细胞类型不限可以是成纤维细胞、上皮细胞、胚胎干细胞等)，将同一个体的同类细胞分成两组，其中一组转染外源基因，另一组不转染外源基因；(2)分别用上述两组细胞制备克隆(SCNT)动物，并分别获得同一细胞系、同一细胞类型、相同年龄的转基因和非转基因克隆动物；(3)分析转基因与非转基因两组动物的表型差异，及它们的组织样品进行相关生物学试验，对转基因动物作出安全性评价。本发明的方法应用同一细胞系分别培养转基因细胞和非转基因细胞(可以用不同细胞类型包括成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞或干细胞)，转基因细胞与非转基因细胞来自同一个体，同样代次、相同的培养时间及培养条件。本发明方法中应用同一雌性动物卵母细胞。
本发明方法中用同一细胞系制备的转基因细胞和非转基因细胞两种细胞分别进行体细胞克隆(SCNT)，获得染色体遗传背景相同的转基因与非转基因克隆动物；对来自相同细胞系的转基因与非转基因动物进行蛋白质、核酸及生理、生化分析，比较两差异，获得精确的生物学比较信息。本发明方法用于转基因哺乳动物新品种培育生物安全性评价；本发明方法用于转基因哺乳动物工业生产、医药及对环境影响评价；
本发明方法用于对转基因哺乳动物外源基因的表型分析与产物质量和数量评定。本技术应用细胞培养制备转基因(transgenic cells)与非转基因细胞系，细胞培养用DMEM培养液，加10-15胎牛血清(FCS)，其中转入的外源基因是线性化的DNA，细胞转基因应用目前普遍使用的方法(电转染、脂质体转染)，DNA片段长度可0. l-300kb)。本技术应用体细胞克隆(体细胞核移植)的方法制备相同遗传背景的转基因和非转基因动物。采用与体细胞同种的雌性哺乳动物为供质(提供诳母细胞质)动物，卵母细胞处于M II期。M II期卵母细胞去除细胞核，并将上述培养的转基因与非转基因细胞移入去核卵母细胞中，制备重构卵，重构卵移入代孕雌性动物，出生相同染色体遗传的转基因与非转基因动物。
图1是转基因动物重组产物精确分析检验方法技术路线图。图2是羊乳蛋白电泳图谱。图3是DNA指纹图谱。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施实例
本发明方法路线图如图1所示，参照图1，一个具体的实施例如下。实验材料
1. 1哺乳动物乳腺特性表达载体PBnLCH参照文献成勇博士论文“乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达”和成勇、等《南京农业大学学报》“酪蛋白和巨细胞病毒复合启动子激活人乳铁蛋白cDNA基因在转基因小鼠乳腺中表达”进行构建。
1. 2用于分子克隆的酶及试剂盒来自国内的生物工程公司。
1. 3 方法
⑴质粒提取溶液 I :50mM 葡萄糖，25mMTris · Cl (PH8.0)，IOMmEDTA(PH8.0)，高压灭菌15min ；质粒提取溶液II :0. 4NNaOH, 2%SDS ；质粒提取溶液III :5M乙酸钾60ml，冰乙酸说 11. 5ml,水 28. 5ml, 4°C保存。4NNa0H、10% SDS、5MLiCl、3MNaAc、lMCaCL2。⑵LB液体培养基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaClIOg,溶于800ml水中，调节PH值至7. 5，定溶至1000ml,高压灭菌；TE缓冲液=IOmMTris. Cl, ImMEDTA, PH8. 0，高压灭菌。⑶用CaCl2制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，细胞菌落的快速裂解及质粒大小的检查，质粒DNA的小量制备，质粒DNA的大规模制备，细菌的保种等实验参照按金冬雁等译《分子克隆实验指南》第二版。(4) pgCN/LF/g、pbCN/LF、pgCNCG/LF25、pBnLC2G 和 pbCNCS/LF36 质粒用I 和Not I 37°C酶切反应3小时，电泳后获得到大小约为9-201Λ和31Λ的两条条带，回收并纯化前者DNA。2.线性化基因片段电转染山羊胎儿成纤维细胞
⑴细胞中加入Iml Hypoosmolar Electroporation Buffer悬浮细胞，细胞悬液加入基因片段并混合，DNA的终浓度应为5 20μ g/ml，在Multiporator中电穿孔。⑵细胞电转染M-48小时后进行药物筛选，并准备没有转染外源基因的胎儿成纤维细胞作为阴性对照。⑶加500μ1新鲜的含200μβ/π^418的乳腺上皮细胞培养液。待细胞长满M孔板后将其转入六孔细胞培养板中扩大培养。⑷细胞DNA经PCR反应能扩增出大小约为95^ρ的条带，则证明该细胞系中整合了外源基因。体细胞核移植3.1材料
3. 1. 1主要仪器
Olympus万能显微镜(日本太阳交易株式会社);Leitz显微操作仪(德国Leica公司)；CE-900型电融合仪(中国科学院发育生物研究所)；体视显微镜(成都东方光学仪器厂) ’磨针仪(EG-4 Micro-grinder，日本 NARISHIGE 公司)；拉针仪(PB-7 Micro-pipette Puller,日本NARISHIGE公司);锻针仪(MF-90 Microforge,日本NARISHIGE公司);0)2培养箱(美国Forma Science he.)；超净工作台(苏州净化仪器设备厂)；方杯(定制)；吸卵管(自制)。3. 1.2显微操作用针
显微操作用持卵针、注射针外径1. 25mm的玻璃毛细管经拉针、锻针和磨针制得。3.1.3主要试剂(若无特殊说明，各药品均购自美国Sigma公司)
(1)M16盐液=NaCl 5. 533 g/L+ KCl 0. 356 g/L+ CaCl2. 2H20 0. 252 g/L+ MgSO4 0. 143g/L+ KH2PO4 0.162 g/L+ NaHCO3 2.101 g/L+ Sodium Pyravate 0.036 g/L+ D-Glucose1.000 g/L+ Penicilling-G 0.060 g/L+ Streptomgcin 0.050 g/L+ Sodium Lactate 3. 70ml/L+ Phenol Red(A little)
(2)M2盐液将Mni盐液配方中的NaHCO3含量改为0.349g，再加入Hepes 4.969 g，其余同M16盐液。(3)显微操作液M2 盐液 +10% FBS + 7. 5 μ g/ml CB
(4)重构卵(胚)培养液=M16盐液+10% FBS
(5)电融合液0.3M Mannitol+0. 05mM MgS04+0 . 05mM CaCl2+0. 5mM Hepes + 0. 05%BSA
(6)6-DMAP IOOX 称取 6-DMAP 粉末 9. 3mg，溶解于 0. 285ml DMSO 中 5(7) CB储存液称取5mgCB粉末，溶解于2. 5mlDMS0中3. 2. 方法
3. 2. 1供质卵母细胞的准备
同一个体卵母细胞处理(2-10 μ g/ml DIAP,3-8y g/μ 1细胞松驰素。3. 2. 1. 1 M II期卵母细胞的回收
收集去除颗粒细胞的M II期卵母细胞。体视显微镜下检卵，把有和无卵巢颗粒细胞的卵母细胞分别收集，前者用透明质酸酶适当消化去除颗粒细胞。检出的卵在M16+10%FBS培养液中于37°C、5% CO2、饱和湿度CO2培养箱中培养至使用。使用前，将卵移入显微操作液中，于37°C、5% CO2、饱和湿度CO2培养箱中预培养15 min。3. 2. 1.2 M II期卵母细胞的去核
盲吸法，将卵母细胞(20-30枚/批)移入显微操作液(M2+10%FBS+CB)中预处理20 min,取出，置于培养皿或玻片上的显微操作液滴中，Olympus显微镜下观察，选取第一极体完整的卵母细胞，用持卵针固定，使极体位于3点种方向，去核针穿过透明带，将第一极体连同1/8胞质体积的卵母细胞质一并吸出。3. 2. 2重构胚的制作
3.2. 2. 1 移核
分别用同一细胞系(来自同一胎儿的转基因细胞和非转基因细胞)作为供核细胞制备
克隆羊。用去核针选吸供核细胞，针从去核时在透明带上留下的切口插入，将供核细胞置于卵周隙中。用礼6 (不含CB)清洗重构卵5-6次，并在虬6培养液中恢复培养30min后进行电融合。3. 2. 2. 2 电融合
融合条件直流电，场强l-2kv/cm，脉冲时间20-40 μ s，连续1_3个脉冲。操作过程移核卵经融合液清洗三次后移入盛有融合液的电融合槽两电极之间，用玻璃针调动移核卵使供核细胞与卵母细胞的接触面和电极丝(钼金丝)平行，然后电击；电击后移核卵用礼6清洗三次，移入盛有M16培养液的方杯中于培养箱中培养30min;体视显微镜下检查，选出已融合(重构卵)和正在融合的移核卵。未融合的卵按上述方法再重复1-2次，仍未融合的移核卵弃去。3. 2. 3 激活
激活前，重构卵于M16培养液中培养(培养箱环境37°C、5% CO2、饱和湿度)5小时。激活液，A 液=M16 培养液 +5 μ M 离子霉素 +7. 5 μ g/ml CB, B 液:M16 培养液 +2mM6_DMAP+7. 5 μ g/ml CB。操作步骤用A液清洗重构胚5次，然后常温下在A液中处理5min;再用B液清洗重构胚6次，转移到50 μ 1的B液微滴中(上覆石蜡油)，(X)2培养箱中培养5小时；用M16培养液清洗重构胚9次，然后转移到50 μ 1的M16培养液微滴中(上覆石蜡油)培养至包埋或移植。重构卵经激活后称为重构胚。重构胚的体内培养、回收与移植4.1材料
4.1. 1临时寄母山羊、受体山羊4. 1. 2主要器械山羊常规外科手术器械。4. 1.3主要试剂
低熔点琼脂(美国Sigma公司)；
冲胚胎用 PBS2(含钙、镁):NaCl 8.000 g/L + KCl 0.200 g/L + Na2HPO41. 145
g/L + KH2PO4 0. 200 g/L + CaCl2. 2H20 0. 112 g/L + MgSO4. 6H200. 100 g/L。4. 2 方法
4. 2. 1重构胚的包埋
用1%的低熔点琼脂Agarose双层包埋，用0. 85%的生理盐水煮沸溶解Agarose，并在41-42°C水浴保持液态。操作步骤每次将4-5枚重构胚从M16培养液中移入FBS液滴中，在35mm小塑料皿中倒入l-2ml、41-42°C的l%Agarose，用较细的玻璃管将FBS中的4_5枚重构胚移入Agarose液中(经FBS处理过的吸管管壁不易吸附重构胚)；几秒钟后，将少量Agarose和重构胚一起吸入吸管细段(重构胚要尽量排得均勻，间距适当)，保持Agarose液在吸管中不停地来回移动约半分钟(使其冷却且不粘于管壁)，将Agarose移入M16培养液中，使其凝成一细柱状；用钨丝针切去两端的多余部分，过长的Agarose柱切分为2_3段。按上述方法，用较粗的吸管重新包埋一次。4. 2. 2重构胚的体内培养与回收
经包埋的重构胚移植入同步发情的临时寄母羊的输卵管内，每侧应少于5块，将输卵管口部和输卵管-子宫结合部分别用两道缝线结扎。体内培养5天后，手术取下结扎的输卵管段，用PB&冲洗出Agarose块，于显微镜下观察重构胚的发育情况，用钨丝针将发育较好的重构胚(一般为8-32细胞、桑葚胚、囊胚)从Agarose块中剥离出来，用于胚胎移植。4. 2. 3胚胎移植
经同步发情处理的受体山羊(发情后第5天)，手术移植，腹中线切口暴露卵巢，选用有暗红色黄体的山羊。在靠近子宫大弯处避开血管，用16#针头刺一小孔，经该针孔插入一16#钝针头，移植管从针头中导入子宫腔，将回收的胚胎移植入子宫，2-3枚/只羊，两侧或有黄体侧移植；未经体内培养的激活重构胚可直接移植入同步发情的受体羊输卵管内。5.同一细胞系获得的克隆羊乳汁性状完全一致
图2是羊乳蛋白电泳图谱，其中1和8、Marker(即标准蛋白分子量，上样量为90 μ g)；2、空白；3-5、相同遗传背景的克隆羊乳，C-4，C-50，C-60 ；6、提供体细胞的羊乳(#078) ;7和9、正常对照羊乳。所有样品加样量为200 μ g。从图中可见，来自同一细胞系的克隆羊乳蛋白电泳图谱完全一致，但与对照的正常羊有明显差异，并且两个正常羊的蛋白图谱也有明显差异。表明动物表型的多态性及个体差异，同时显示同一细胞系的克隆羊的表型一致性。箭头所指为同系克隆动物相同的的蛋白条带，而在正常对照动物乳中显示不同的条带宽度或密度。6.同一细胞系的克隆羊遗传编码精确一致
图3为DNA指纹图谱，其中A、078#gene goat，取细胞的羊；B、寄母羊(NT_7 ) ;C、寄母羊NT-34 ；D、克隆羊(C-50) ；E、克隆羊(C-60)。从图3可见，来自同一个体细胞系的克隆羊基因型完全一致，图示为克隆羊和寄母羊的DNA指纹图谱，显示同一细胞系的羊DNA指纹相同，而寄母羊(怀孕克隆羊的母羊)的DNA指纹完全不同。
实例表明，克隆动物在基因型和表型方面有高度的一致性，用于转基因重组产物精确分析是可行的，也是一种新颖的方法。
权利要求
1.一种转基因动物重组产物精确分析检验方法，其特征在于包括以下步骤；(1)将同一个体的同类体细胞分成两组，其中一组转染外源基因，另一组不转染外源基因；(2)分别用上述两组细胞制备克隆动物，并分别获得同一细胞系、同一细胞类型、相同年龄的转基因和非转基因克隆动物；(3)分析转基因与非转基因两组动物的表型差异，及它们的组织样品进行相关生物学试验，对转基因动物作出安全性评价。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述体细胞是成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞或干细胞。
全文摘要
本发明涉及动物转基因新品种培育领域的转基因动物优良性状的客观评定。本发明的技术方案(1)采集一个动物的体细胞，将同一个体的同类细胞分成两组，其中一组转染外源基因，另一组不转染外源基因；(2)分别用两组细胞制备克隆(SCNT)动物，并分别获得同一细胞系、同一细胞类型、相同年龄的转基因和非转基因克隆动物；(3)分析转基因与非转基因两组动物的表型差异，及它们的组织样品进行相关生物学试验，对转基因动物作出安全性评价。应用该方法进行生物安全性评价可消除动物个体差异，获得更加精确的转基因动物生理、生化指标，及转基因动物产品(肉、乳、毛、等)与非转基因动物产品的区别，更加客观地进行转基因产品的生物安全评价。
文档编号A61D19/04GK102391989SQ201110308199
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者成勇 申请人:扬州大学