专利名称：应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法
技术领域：
本发明涉及动物乳腺上皮细胞转基因技术；转基因乳腺上皮细胞诱导表达技术及转基因乳腺上皮细胞核移植技术。
背景技术：
体外转染外源基因的细胞作为供核细胞进行细胞核移植可以获得绝大部分整合外源基因的动物，此方法与传统的显微注射相比效率得到了明显提高。但是，由于外源基因整合位置效应，在这些转基因后代中仅有一部分具有表达外源基因的功能，因而其效率仍然较低。如果能在细胞核移植之前获得具有表达潜能的细胞系，将进一步提高转基因动物的效率。乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能，是乳腺生物反应器的靶细胞，可以用体外培养的乳腺上皮细胞作为转基因载体，可以预测将要获得的转基因动物的表达特性，这可以减少实验动物的数量，缩短研发时间，提高效率。本发明应用乳腺上皮细胞诱导表达技术和体细胞克隆技术，制备高效乳腺特异性表达转基因动物，从而获得表达外源基因的转基因动物，达到转基因的最终目标。动物转基因技术在农业、医学和基础研究中有广泛的应用，乳腺上皮细胞能合成并分泌目的蛋白到培养液中，通过检测诱导表达目的蛋白产物来筛选高效表达的细胞，该方法成本低、可靠性高。本专利可应用于转基因乳腺生物反应器制备、转基因家畜育种及转基因动物模型的制备及乳腺特异表达载体的效能评估。
发明内容
外源基因在动物乳腺特异性表达可用于制备转基因动物乳腺生物反应器，也可用于奶牛、奶山羊等乳品改良及转基因动物新品种培育。在乳腺特性表达转基因动物制备中， 获得高效表达动物是其最终目的，但通过现有技术制备乳腺特异性表达转基因动物的效率较低，虽然通过体细胞克隆技术可以得到随机整合动物，但这些整合个体中仅有少部分具有外源基因表达功能。如果在制备转基因动物的前期(细胞培养阶段)就能对选择的细胞系是否具有潜在的个体表达功能，将大大提高转基因动物制备效率。本发明提供了一种高效制备乳腺特异性表达转基因动物的技术。本发明的技术方案为动物乳腺上皮细胞转基因一转基因乳腺上皮细胞诱导表达 —具有表达功能的乳腺上皮细胞核移植一获得乳腺特性表达转基因动物。一种应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，包括以下步骤
(1)外源基因通过表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，并应用催乳素3_8μΜ诱导表达；(2)筛选获得高效表达乳腺上皮细胞系；(3)高效表达细胞系进行一步或二步细胞核移植，获得乳腺特异性表达个体。本发明进一步优选的技术方案推荐步骤(2)具体为取每株细胞中的1/2-1/3细胞传代培养至50-80%丰度时在培养液中添加催乳素(3_8μΜ)诱导外源基因的表达，在 24-96小时取上清液进行外源基因表达检测(ELISA或其它生物检测手段)。
本发明优选的技术方案还有在步骤(3)具体为用筛选到高表达细胞系作为供核细胞进行细胞核移植.其中部分20-50天的克隆胎儿进行二次核移植，提高获得表达个体频率。本发明可提高转基因动物制备效率，节省材料60%_80%，缩短转基因动物研究开发时间。本发明可用于基因构件表达性能评估、转基因动物乳腺生物反应器研制、生物制药、 动物转基因生物新品种培育等。
图1是表达载体基本结构。图2是乳腺特异性表达转基因动物的制备方法示意图。图3是用于转染乳腺上皮细胞的pBnCL14线性DNA结构图。
具体实施例方式实验材料
培养液DMEM/F12 ；胎牛血清FCS ；电转染液(Hypoosmolar Buffer)从^pendorf公司购；FSH，LHRH和PG从宁波激素厂购；其他涉及的化学试剂均可从Sigma公司或国内其它生物工程公司购得.实验用山羊。.人溶菌酶转基因乳腺上皮细胞制备 2.1乳腺上皮细胞分离和培养
无菌手术切取大约5 g左右的泌乳期山羊乳腺组织，组织剪成约1 mm3大小，用I型胶原/透明质酸酶消化液(含I型胶原酶200 IU/mL，透明质酸酶100 IU/mL)振荡消化，收集细胞悬液，D-hank’ s洗涤3次，细胞计数并用培养液(含DMEM/F12，10% FCS,乙酸钠5 mmol/L，转铁蛋白5 Pg/mL，乙醇胺0. 5 mmol/L，胰岛素10 Pg/mL，氢化可的松5 Pg/mL)以 4X IO5个/mL接种于六孔细胞培养板，置CO2培养箱中37°C、5%C02、饱和湿度下静置培养。细胞转染、筛选
用5 / I和Λ^ I双酶切pBnCL14质粒(图3)(可参考成勇博士论文，2007年，乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达)获得线性化人溶菌酶乳腺特异性表达载体(图2)，经QIAEX试剂盒回收。收集对数期乳腺上皮细胞，用电转染液洗涤离心后重悬细胞密度至 1 X IO6 个 /mL,加入 DNA 使终浓度为 8_2(^g/mL，以 1. 0-2. 0 KV/cm, 50-100 Ps 的条件电击一次，转染后400 Pg/mL G418筛选，挑取克隆细胞以200-30(^g/mL G418维持培养。细胞整合和表达产物的检测.冷冻细胞同时每孔取一半扩增至80%的丰度后，在培养液中加入催乳素(3_8μΜ)诱导人溶菌酶的表达，48 h后收集培养液进行SDS-PAGE电泳和 Western-blot 检测。.供体羊与受体羊的准备
供体羊和受体羊均为波尔山羊与长江白山羊杂交羊.供体羊注射PG，于发情后第9 13天开始超排。连续3天注射FSH，每天2次，总剂量260 300单位。第4天下午注射 PG,第5天注射50单位LHRH。受体羊的同步除不注射FSH外均同供体羊。.供核细胞与卵母细胞的准备冷冻乳腺上皮细胞解冻后培养至80%汇合后，在0. 5% FCS培养液中饥饿48小时，于核移植前2小时胰蛋白酶消化处理，用M2悬浮细胞备用。卵母细胞在注射⑶冊后沈 30 小时输卵管手术冲取，用透明质酸酶消化并吹打去除颗粒细胞。.核移植、融合和激活
卵母细胞预先置于含7. 5 Pg/mL CB的M2中处理20 min，重构胚移入M16中培养30 60 min后开始融合(融合液0. 3 mmol/L甘露醇、0. 05 mmol/L氯化钙、0. lmmol/L硫酸镁、 3% BSA)，条件为2. 1 KV/cm、40 Ps、2个脉冲。在激活液(5 Mmol/L离子霉素+ 7.5 mg/mL CB)中5 min ；然后移入M16中短暂培养直到胚胎移植。.胚胎移植
激活后培养的胚胎手术法移入同步发情受体的输卵管内，每只受体移植4 15枚胚胎.在胚胎移植后30、60和90天进行B超诊断妊娠情况。.转基因羊鉴定
引物设计应用I^imer Premier5. 0软件，为了提高PCR检测的可靠性，引物的上游引物以Pcmv或5 ’端调控序列下游部分为模板，下游引物以hLF为模板的跨接头设计，扩增产物为 550 IOOObp0PCR反应混合物组成 组成成分
①IOXbuffer (含 Mg)
②dNTP(IOmM)
③permier I(20uM)
④permier II(20uM)
⑤Taq (5u/μ 1)
⑥模板DNA
⑦灭菌蒸馏水PCR循环参数(热启动法) 95 0C变性5min ；(加聚合酶)；94°C变性45s，56-61 °C复性45s，72 °C延伸30s，共
20-30个循环；然后72°C延伸lOmin，最后于4°C保温。PCR产物于1. 4%凝胶中电泳。
加入量
5 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 0. 5μ 1
1 μ 1 up to 50 μ L0
终浓度
IX 200uM 0. 4uM 0. 4uM
200ng
权利要求
1.应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，包括以下步骤(1)将外源基因通过表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，并应用催乳素3-8μΜ诱导表达；(2)筛选获得高效表达乳腺上皮细胞系；(3)高效表达细胞系进行一步或二步细胞核移植，获得乳腺特异性表达个体。
2.根据权利要求1所述的应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法， 其特征在于步骤(2)中，取每株细胞中的1/2-1/4的细胞传代培养至80%丰度，在培养液中添加催乳素3-8μΜ诱导外源基因的表达。
3.根据权利要求2所述应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，其特征在于分别在Μ-96小时取细胞上清液进行表达产物检测。
4.根据权利要求1所述应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，其特征在于细胞核移植所用的供核细胞是经步骤(2)和(3)筛选的特殊细胞系。
5.根据权利要求4所述应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，其特征还在于乳腺上皮细胞体细胞核移植后20-50天的胎儿用作供核细胞，进行二步克隆。
全文摘要
本发明涉及应用乳腺上皮细胞制备乳腺特异性表达转基因动物的方法，该方法包括以下步骤(1)将外源基因通过表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，并应用催乳素3-8μM诱导表达；(2)筛选获得高效表达乳腺上皮细胞系；(3)高效表达细胞系进行一步或二步细胞核移植，获得乳腺特异性表达个体。本发明方法可提高转基因动物制备效率，应用该技术可以在细胞筛选阶段预测其转基因动物的表达特性，提高乳腺特异表达转基因动物制备效率3倍。由于整合的位置效应，获得的转基因个体表达几率在10-30%，并且可能出现低水平表达。应用这一技术系统可在制备转基因细胞的同时鉴定将要获得个体的表达潜能，从而获得更多的表达动物。
文档编号A61D19/04GK102358894SQ201110308200
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者成勇, 袁玉国 申请人:扬州大学