专利名称：一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法
技术领域：
本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种红麻组织培养中子叶不定芽的诱导方法。
背景技术：
红麻(kenaf，历力isc^s cannabinus L.)具有纤维产量高、适应性广、抗逆性强、耐旱、耐盐碱、耐粗放、速生和易栽培等特性。它不仅被公认是可替代木浆的造纸原料，也是传统的麻纺的重要工业原料作物。我国红麻育种单产水平和栽培总面积及总产居世界首位， 其生物产量为森林的3-4倍，CO2吸收能力为森林的4-5倍，4个月生长周期内干物质积累可达22. 5t/ha，排氧量为沈557. 5Kg/ha, CO2吸收量达36517. 8Kg/ha，被誉为21世纪发展低碳经济，保护生态环境的优势作物，倍受国际社会的重视和青睐。植物组织培养经过百余年的发展，已经成为生物科学中一项不可或缺的技术，它对提高作物育种或遗传转化效率有重要的科学意义。我国麻类组织培养在快速繁殖、花药培养、原生质体培养、体细胞胚发生、器官发生等研究方面取得了一定的进展。但是这些技术都不太完善和成熟，尚未形成一套成熟、稳定、高效的再生系统，这也成为了红麻转基因育种滞后和制约发展的瓶颈。所以建立一套成熟、稳定、高效的红麻再生体系，对红麻的转基因育种具有重要意义。在红麻组织培养中，虽有利用多种植物激素进行不定芽增殖的研究。如TDZ、NAA、 6-BA、2，4-D、IBA、KT等，但是关于其他调节因子的研究较少。在组织培养中，外植体不定芽的增殖率，往往成为评判一个组培体系优劣的标准。离体培养的植物会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和增殖，AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而抑制乙烯的活性。本发明针对AgNO3在红麻不定芽诱导中的影响进行研究，这在红麻组织培养中尚属首例。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法。本发明的目的通过如下技术方案实现
本发明的提高红麻子叶不定芽诱导的方法，以红麻种子无菌苗子叶为外植体材料进行不定芽诱导、增殖，不定芽诱导培养基为MS+0. l-3mg/L TDZ+ 0. 01-lmg/L NAA+0. l-3mg/L AgNO3,不定芽诱导培养基为MS+ang/L 6-BA+O. lmg/L IBA+100mg/L LH0以上不定芽诱导、 增殖的培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为20000LX、温度为沈士1°〇的条件进行培养。所述方法的具体步骤包括红麻种子经消毒、无菌处理后，于MS培养基上进行光、暗培养，在光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为20000LX、温度为沈士 1°C的条件下培养7-10d，然后将完整子叶切割成3-5 X 3-5mm2的长条接种在不定芽诱导培养基上培养30-40d，再将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖。增殖后产生的不定芽用于诱导植株再生，操作方法为当不定芽生长至34cm 时，将不定芽从外植体上切割下来，分割成单株的无根苗接种于不定芽生根培养基 MS+0. 05mg/L NAA，诱导产生根，即可形成完整的植株。所述不定芽诱导培养基的配制包括以下步骤 (IWfMS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；
(2)加入TDZ, NAA,用蒸馏水定容，pH值用lmol/L NaOH调至5. 8-6. 0 ；
(4)溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；
(5)0. lMpa、121°C高压灭菌 20min ；
(6)冷却至50-60°C，在超净工作台中操作，加入AgNO3，然后分装到无菌的培养瓶中即为不定芽诱导培养基。所述不定芽增殖培养基的配制包括以下步骤 (IWfMS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；
(2)加入6-BA、IBA，用蒸馏水定容，pH值用lmol/LNaOH调至5. 8-6. 0 ；
(3)溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；
(4)0. lMpa、121°C高压灭菌 20min ；
(5)冷却至60°C左右，在超净工作台中操作，加入水解乳蛋白LH，然后分装到无菌的培养瓶中即为不定芽增殖培养基。所述不定芽生根培养基的配制包括以下步骤 (IWfMS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；
(2)加入NAA，用蒸馏水定容，pH值用lmol/LNaOH调至5. 8-6. 0 ；
(3)将溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；
(4)0. lMpa、121°C高压灭菌 20min ；
(5)冷却至60°C左右，在超净工作台中操作，将其分装到无菌的培养瓶中即为不定芽生
根培养基。培养基中，所述的TDZ，是一种人工合成的、高效的植物生长调节剂，其作用类似于细胞分裂素，能诱导乙烯产生；所述的NAA，是一种用于植物组织培养的生长素；6-BA为植物细胞分裂素，IBA为植物生长素；LH为水解乳蛋白。本发明的显著优点
本发明利用AgNO3提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，在不定芽的诱导过程中可以有效抑制愈伤组织的形成，并缩短不定芽增殖的时间。不定芽的增殖率在不添加AgNO3时，不定芽增殖时伴随大量愈伤组织产生，影响不定芽的生长，且给实验操作带来不便；此外，其增殖时间长，不定芽诱导率为64%。添加AgNO3后几乎没有愈伤组织产生，不定芽增殖时间缩短了 2周，不定芽诱导率提高到85%。结果表明添加AgNO3对红麻不定芽的增殖有明显的促进作用，它使红麻不定芽的诱导率显著提高，达到85%。这说明，日后在其他作物的组培研究工作中，也可以对添加后 AgNO3的作用进行相应的研究，而AgNO3可能成为广泛适用于植物组培方法改良的一种有效手段。在其他作物的组织培养中，对AgNO3的研究较少，本发明中利用添加适当浓度AgNO3提高了红麻子叶不定芽的诱导率，这在麻类组织培养中属首创，也可为红麻外源基因转化提供一种快速、高效、稳定的再生系统，从而提高红麻转基因育种的效率。AgNO3在红麻组织培养中的利用，同样也可以推广到其他麻类作物的组织培养的研究，这种方法可以改变麻类作物组织培养不定芽诱导难和诱导率低的问题。此外，对麻类组织培养体系优化有重要的促进作用，也给其他作物提供了一条新的研究思路，AgNO3有可能成为提高和完善其他作物组织培养技术的关键因子。这种可能的实现将会使植物组织培养走向一个更新、更高的平台，促进植物组织培养技术进一步完善和发展。
图1为红麻种子消毒后接种于MS培养基； 图2为红麻子叶接种于诱导培养基；
图3为子叶诱导不定芽产生芽点； 图4子叶分化出不定芽； 图5为不定芽进行生根培养； 图6为生根培养后形成完整植株。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围
实施例1
(1)将培养7-10d后的红麻无菌苗子叶，在超净工作台中切成3 X 4mm2的长条，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d，不定芽诱导培养基为MS+0. lmg/L TDZ+0. 01mg/L NAA+ 0. lmg/L AgNO30(2)将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖，不定芽 ±曾殖培养基为:MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA。(3)当不定芽生长至34cm时，将其分割接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA,诱导产生根，即可形成完整的植株。结果显示，通过本实施例进行红麻不定芽的诱导，子叶的不定芽诱导率为3. 03%。实施例2:
(1)将培养7d后的红麻无菌苗子叶(福建农林大学保存的红麻品种福红992的种子， 经常规消毒后于MS培养基中光、暗培养，光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为20000LX、温度为沈士1°0，于超净工作台中切成3X5mm2的长条，接种于不定芽诱导培养基中培养30d左右，不定芽诱导培养基为MS+0. lmg/L TDZ+0. lmg/L NAA+ 1. Omg/L AgNO30(2)将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖，不定芽 ±曾殖培养基为:MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA。(3)当不定芽生长至34cm时，将其分割接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA,诱导产生根，即可形成完整的植株。以上培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为20000LX、温度为的条件进行培养。结果显示，通过本实施例进行红麻不定芽的诱导，子叶的不定芽诱导率为85%。实施例3
(1)将培养8d后的红麻无菌苗子叶，于超净工作台中切成4X5mm2的长条，接种于不定芽诱导培养基中培养30d左右，不定芽诱导培养基为MS+lmg/L TDZ+0. lmg/L NAA+3mg/L AgNO30(2)将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖，不定芽 ±曾殖培养基为:MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA。(3)当不定芽生长至34cm时，将其分割接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA,诱导产生根，即可形成完整的植株。以上培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为 20000LX、温度为的条件进行培养。结果显示，通过本实施例进行红麻不定芽的诱导，子叶的不定芽诱导率为25%。实施例4:
(1)将培养9d后的红麻无菌苗子叶，于超净工作台中切成3-5X3-5mm2的长条，接种于不定芽诱导培养基中培养35d左右，不定芽诱导培养基为MS+lmg/L TDZ+lmg/L NAA+0 .lmg/L AgNO30(2)将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖，不定芽 ±曾殖培养基为:MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA。(3)当不定芽生长至34cm时，将其分割接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA,诱导产生根，即可形成完整的植株。以上培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为 20000LX、温度为的条件进行培养。结果显示，通过本实施例进行红麻不定芽的诱导，子叶的不定芽诱导率为43. 9%。实施例5
(1)将培养IOd后的红麻无菌苗子叶，于超净工作台中切成3-5X3-5mm2的长条，接种于不定芽诱导培养基中培养40d左右，不定芽诱导培养基为MS+;3mg/L TDZ+0. lmg/L NAA+ 0. lmg/L AgNO30(2)将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖，不定芽 ±曾殖培养基为:MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA。(3)当不定芽生长至34cm时，将其分割接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA,诱导产生根，即可形成完整的植株。以上培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为 20000LX、温度为的条件进行培养。结果显示，通过本实施例进行红麻不定芽的诱导，子叶的不定芽诱导率为40%。实施例6:
(1)将培养8d后的红麻无菌苗子叶，于超净工作台太中切成2 X 3mm2的长条，接种于不定芽诱导培养基中培养30d左右，不定芽诱导培养基为MS+;3mg/L TDZ+lmg/L NAA+ lmg/L AgNO30
(2)将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖，不定芽 ±曾殖培养基为:MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA。(3)当不定芽生长至34cm时，将其分割接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA,诱导产生根，即可形成完整的植株。以上培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为 20000LX、温度为的条件进行培养。结果显示，通过本实施例进行红麻不定芽的诱导，子叶的不定芽诱导率为5. 71%。通过以上实施例得出，实施例2红麻子叶不定芽的诱导最高，达到了 85%。此种方法可以大大提高红麻组织培养的效率，为红麻转基因育种奠定了良好的基础。
权利要求
1.一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，其特征在于，以红麻种子无菌苗子叶为外植体材料进行不定芽诱导、增殖，不定芽诱导培养基为MS+0. l-;3mg/L TDZ+ 0. 01-lmg/L NAA+0. l-3mg/L AgNO3,不定芽增殖培养基为MS+2mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA+100mg/L LH ；以上不定芽诱导、增殖的培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为20000LX、温度为的条件进行培养。
2.根据权利要求1所述的提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括红麻种子经消毒、无菌处理后，于MS培养基上进行光、暗培养，在光、 暗培养时间分别为14h和IOh循环进行、光照强度为20000LX、温度为的条件下培养7-10d，然后将完整子叶切割成3-5X3-5mm2的长条接种在不定芽诱导培养基上培养 30-40d，再将诱导培养后的子叶转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖。
3.根据权利要求2所述的提高红麻子叶不定芽诱导的方法，其特征在于，增殖后产生的不定芽用于诱导植株再生，操作方法为当不定芽生长至34cm时，将不定芽从外植体上切割下来，分割成单株的无根苗接种于不定芽生根培养基MS+0. 05mg/L NAA，诱导产生根， 即可形成完整的植株。
4.根据权利要求1所述的提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基的配制包括以下步骤(IWfMS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；(2)加入TDZ, NAA,用蒸馏水定容，pH值用lmol/L NaOH调至5. 8-6. 0 ；(4)溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；(5)0. lMpa、121°C高压灭菌 20min ；(6)冷却至50-60°C，在超净工作台中操作，加入AgNO3，然后分装到无菌的培养瓶中即为不定芽诱导培养基。
5.根据权利要求1所述的提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，其特征在于，所述不定芽增殖培养基的配制包括以下步骤(IMfMS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；(2)加入6-BA、IBA，用蒸馏水定容，pH值用lmol/LNaOH调至5. 8-6. 0 ；(3)溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；(4)0. lMpa、121°C高压灭菌 20min ；(5)冷却至60°C左右，在超净工作台中操作，加入水解乳蛋白LH，然后分装到无菌的培养瓶中即为不定芽增殖培养基。
6.根据权利要求1所述的提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，其特征在于，所述不定芽生根培养基的配制包括以下步骤(IMfMS中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及蔗糖混合；(2)加入NAA，用蒸馏水定容，pH值用lmol/LNaOH调至5. 8-6. 0 ；(3)将溶液分装至锥形瓶中，加入琼脂粉；(4)0. lMpa、121°C高压灭菌 20min ；(5)冷却至60°C左右，在超净工作台中操作，将其分装到无菌的培养瓶中即为不定芽生根培养基。
全文摘要
本发明提供了一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，该方法以红麻种子无菌苗子叶为外植体材料进行不定芽诱导、增殖，不定芽诱导培养基为MS+0.1-3mg/LTDZ+0.01-1mg/LNAA+0.1-1mg/LAgNO3，不定芽增殖培养基为MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+100mg/LLH。该技术可以缩短红麻子叶诱导不定芽的时间，同时提高了不定芽的诱导率，为红麻的转基因研究奠定了良好的基础，同时提高了其遗传育种的效率。
文档编号A01H4/00GK102487818SQ20111037247
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者刘国忠, 吴建梅, 徐建堂, 方平平, 林培清, 林荔辉, 池仁漫, 祁建民, 秦先超, 陶爱芬 申请人:福建农林大学