专利名称：一种促使梨品种间授粉完全亲和的方法
技术领域：
本发明属于植物授粉生物学领域，涉及一种促使梨品种间授粉完全亲和的方法。
背景技术：
梨是我国乃至世界主要水果之一，我国现有栽培面积125. 84万公顷，是我国的第三大水果。梨属于配子体型自交不亲和性果树，绝大多数品种自花授粉不结实，在生产上必须配置授粉树，才能获得预期的产量和品质。但采用人工授粉时应避免所用花粉和被授粉树的S基因型相同，否则不能完成受精、无法坐果，严重影响产量，甚至绝收。这就使得我们对梨品种授粉树的选择存在着一定的取舍，只能选用与之S基因型不同的品种做授粉树。 但对那些未知S基因型的梨品种授粉时往往不知道应该选用哪些品种做授粉树才能保证生产，在授粉时会存在一定的盲目和侥幸的心理，在生产实践中，各地都有存在一些梨园因建园时授粉品种配置不当或人工辅助授粉品种选择不当而造成仅开花不结果的问题，给生产者带来巨大的经济损失。鉴于此，寻找一种促使梨品种间杂交完全亲和的授粉方法显得尤为重要。‘金坠梨’是‘鸭梨’的芽变品种，虽然其品质特性与‘鸭梨’基本一致，但自花结实率高达70%以上。本课题组研究结果显示(吴华清，张绍铃，吴巨友.‘金坠梨’自交亲和性突变机制的初步研究.园艺学报，2007，34，2 :295-300)，‘鸭梨，自花结实率仅2%，自花花粉管在花柱中中部已经停止生长(图2-B)；而‘金坠梨’自花结实率高达76%，自花花粉能正常生长至花柱基部(图2-A)；有趣的是‘鸭梨’雌蕊能够接受‘金坠梨’花粉并受精结实(图2-C)，而‘金坠梨’雌蕊却与‘鸭梨’花粉杂交不亲和(图2-D)。进一步鉴定了 ‘鸭梨’和‘金坠梨’都是基于S-RNase基因的S基因型，两者S基因型一样，均为S21^ ；通过克隆两品种S-RNase基因cDNA全长序列，并进行比较分析发现，该两品种的1对雌蕊S-RNase 基因在核苷酸序列上完全相同，且都正常表达，表达量也没有明显差异(图幻，这从分子水平上证实了 ‘金坠梨’在雌蕊方面和‘鸭梨’并无差异，其自交亲和的原因是由于雄蕊的特异性识别功能丧失而导致的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种促使梨品种间授粉完全亲和的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种促使梨品种间授粉完全亲和的方法，用‘金坠梨’花粉对其他梨品种进行人工授粉。其中，所述的梨品种‘黄花’、‘丰水’、‘新雅’、‘新雪’、‘大水核’、‘新梨一号’、‘水晶’、‘台湾蜜梨’、‘红皮酥’、‘大南果’、‘胎黄梨’、‘圆香’、‘大理鸡腿’、‘灌阳雪梨’、‘冬黄’、 ‘鸭梨’、‘库尔勒香梨’、‘香椿’、‘晶玉’、‘苍溪雪梨’、‘红皮酥’、‘大慈梨’、‘晋蜜梨’、‘早蜜’、‘京白’、‘中梨二号’、‘奥连’、‘宝珠梨’、‘雅清’、‘早美酥’、‘满天红’、‘锦香’、‘鹅酥’、‘麦梨’、‘内蒙古山梨’、‘黄皮水’和‘政和大雪梨’包含了目前Genebank中已登录的所有梨 S-RNase 基因。所述的‘金坠梨’花粉通过如下方法制备采含苞待放的‘金坠梨’大铃铛花，揉搓花朵，使花药与花丝分离，用粒径为1 3mm的细孔筛筛下花药。花药在温度20 25°C、相对湿度70% 80%、无阳光直射的室内单层摊勻，经1 2天后即可散出花粉；爆出的花粉用石蜡纸分装包好，置于变色硅胶盒内，外用锡纸包扎整齐，冷藏或置于液氮内冷冻贮运。在授粉前1天，先将花粉从冷藏环境中取出，平摊在洁净的油光纸上，放入在阴暗、潮湿的环境中，经24 48个小时左右的适应及吸潮过程，方可进行授粉；或者在授粉前 1天，先将花粉从液氮冷冻环境中取出，依次在_73°C、-20°C、4°C中分别放置24小时，然后平摊在洁净的油光纸上，放入在阴暗、潮湿的环境中，经24 48个小时左右的适应及吸潮过程，方可进行授粉。所述授粉的时间优选所授品种的初花期，上午10点至下午4点花心柱头上有分泌粘液的时期。所述的初花期为15 25%的花开放的时期。所述授粉的方法优选人工点授法、喷粉法或液体喷雾授粉法。所述的人工点授法为将处理好的花粉按其特征在于所述的人工点授法为将处理好的花粉与填充剂按质量比1 3 5的比例配好充分拌勻装入干燥的瓶中，用带橡皮头的铅笔或鹅毛耳棒沾少许花粉，轻点初开花朵，一次授3-5朵花，每个花序点授2朵边花，勿授弱花、梢头花；所述的喷粉法是花粉与填充剂按质量比1 10 15的比例配好，经拌勻混合，装入喷粉器或授粉器中，对着盛花初期的树均勻喷布；所述的液体喷雾授粉在纯净水或蒸馏水中加入花粉、尿素、砂糖、琼脂粉、硼砂，所述的净水或蒸馏水花粉尿素砂糖琼脂粉硼砂的质量比为 1000 2 3 50 1 1，用超低容量喷雾器喷洒。‘金坠梨’花粉作为“万用花粉”在梨树人工授粉中的应用。用‘金坠梨’花粉对其他梨品种进行人工授粉，由于‘金坠梨’雄蕊特异性识别功能丧失，这使得‘金坠梨’花粉与任一 S基因型的梨品种授粉时均能表现为授粉亲和，使被授粉的品种能够完成受精、正常坐果。因此，‘金坠梨’花粉是一种亲和型的“万能”梨树授粉花粉，可为梨果稳产增收提供简便易效的技术保障。有益效果本发明所提供的促使梨品种间杂交完全亲和的授粉方法，具有以下优点(1)本发明在前期研究证实‘金坠梨’自交亲和的原因是由于雄蕊的特异性识别功能丧失而导致的基础上，选取37个梨品种(这些品种包含了目前Gene Bank里登录的所有梨S基因)，研究了利用‘金坠梨’花粉和其它梨品种授粉，以达到杂交授粉完全亲和的目的的可能性。结果显示通过‘金坠梨’花粉和这些品种进行杂交授粉，田间坐果率统计结果显示各杂交组合花序坐果率均高达70%以上，表现为杂交亲和。这一结果说明，‘金坠梨’花粉和任一 S基因型的梨品种授粉时均表现为杂交亲和，证实了可以利用‘金坠梨’雄蕊特异性识别丧失的这一特性，使得‘金坠梨’花粉可以成为梨树杂交授粉的‘万能花粉’。(2)传统的人工授粉应避免所用花粉和被授粉树的S基因型相同，使得对授粉树的选择存在着一定的取舍。这使得对不同的主栽品种授粉时，还需使用不同种类的花粉。本发明只需采用‘金坠梨’这一种花粉即可解决所有梨品种的授粉问题，大大简化了人工授粉工作量。本发明提供的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，利用‘金坠梨’花粉为父本，由于其S基因特异性识别功能丧失，这使得它和任一 S基因型的梨品种授粉时均能表现为杂交亲和，很好的解决了这一技术盲点。(3)本发明将‘金坠梨’花粉经干燥后装于变色硅胶盒内，外用锡纸包扎密封，液氮超低温贮藏。待来年需要用时，将贮藏的花粉进行逐步苏醒，黑暗环境中恢复至室温，完成备用。通过这种方法就能很好的解决梨树生产中花期不遇或异地授粉时花粉的供应问题， 方法易行、有效。‘金坠梨’花粉量大、花粉萌发率高，是梨品种授粉的很好材料，又因这种花粉携带着自交亲和的基因，使得它更是培育自花结实品种的优良种质材料，若进行产业化生产和推广，将能形成经济效益良好的花粉种质供应市场。(4)本发明应用前景广阔，经济效益良好。由于单一 ‘金坠梨’花粉就能解决所有梨品种的授粉问题，这一技术将颠覆目前市场上花样繁多的梨花粉供应局面，进行产业化生产将会有着广泛的应用前景和良好经济效益。
图1促使梨品种间授粉完全亲和的流程示意图。图2 ‘金坠梨’和‘鸭梨’自花授粉及相互授粉条件下花柱内花粉管生长情况。A. ‘金坠梨’自花授粉；B. ‘鸭梨’自花授粉；C. ‘鸭梨’早X ‘金坠梨’‘金坠梨，早χ ‘鸭梨，古。图3 ‘鸭梨，和‘金坠梨’ S-RNase基因的RT-PCR分析，其中1. ‘鸭梨，；2. ‘金坠梨，；MMarker0
具体实施例方式实施例1(一 )花粉的制备‘金坠梨’花粉采集方法采含苞待放的‘金坠梨’大铃铛花，带回室内，揉搓花朵， 使花药与花丝分离，用细孔筛筛下花药。雨后采花或花瓣沾有露时，应先晾干再揉搓花朵。 花药在温度20 25°C、相对湿度70% 80%、无阳光直射的室内单层摊勻，经1 2天后即可散出花粉。爆出的花粉用石蜡纸分小包包好，置于变色硅胶盒内，外用锡纸包扎整齐， 以达到干燥遮光的目的。若方便异地需求或长期贮藏‘金坠梨’花粉，则需将其置于液氮内冷藏贮运。( 二 )人工授粉技术本研究所开发的‘金坠梨’人工授粉花粉与普通农家自制的花粉，在工艺上、使用方法上有所不同，因为本研究开发的花粉是经充分除湿干燥的花粉，未经吸湿、适应过程， 花粉不能解除休眠状态。具体步骤如下1、花粉的准备‘金坠梨’花粉能显著提高果树的座果率，改善果形，提高品质。当年刚散出的花粉，一般保存在4°C环境中。为提高花粉的活性和发芽率，确保人工授粉的效果，在授粉前1天，先将4°C保存中的花粉平摊在洁净的油光纸上，放入在阴暗、潮湿的环境中(温度20-250C，湿度70 % )，经过24小时左右的适应及吸潮过程，花粉活性会显著提高，方可进行授粉，否则会严重影响花粉的发芽率及授粉效果。若是竖年或异地使用液氮冷冻贮藏后的‘金坠梨’花粉，则需要将贮藏的花粉进行逐步苏醒，依次在_73°C、_20°C、4°C黑暗环境中各放置24小时，恢复至室温，完成备用。2、授粉时间所授品种的初花期(大约15 25%的花开放)，上午10点至下午4点花心柱头上有分泌粘液为最佳授粉期，以保证花粉在柱头上有良好的发芽条件。3、授粉方法①人工点授法将处理好的花粉按其特征在于所述的人工点授法为将处理好的花粉与滑石粉按质量比1 3的比例配好充分拌勻装入干燥的瓶中，用带橡皮头的铅笔或鹅毛耳棒沾少许花粉，轻点初开花朵，一次授3-5朵花，每个花序点授2朵边花，勿授弱花、梢头花；②喷粉法该方法省力、高效，适合劳力少的大规模的果园使用。具体方法是花粉与滑石粉按质量比1 10的比例配好，经拌勻混合，装入喷粉器或授粉器中，对着盛花初期的树均勻喷布③液体喷雾授粉在IOkg水(纯净水或蒸馏水)中加入花粉20g、尿素30g、砂糖 500g、琼脂粉10g、硼砂10g，用超低容量喷雾器喷洒，为确保授粉效果，配好后在1小时内喷
元ο(三)‘金坠梨’花粉促使梨品种杂交授粉完全亲和的验证为了验证‘金坠梨’花粉是否能促使梨品种杂交授粉完全亲和，本研究选取37个梨品种，这些品种包含了目前Gene Bank里登录的所有梨S基因。通过‘金坠梨’花粉和这些品种进行杂交授粉，田间坐果率统计结果显示各杂交组合花序坐果率均高达70%以上， 表现为杂交亲和(表1)。这一结果说明，‘金坠梨’花粉和任一 S基因型的梨品种授粉时均表现为杂交亲和，证实了可以利用‘金坠梨’雄蕊特异性识别功能丧失的这一特性，使得‘金坠梨’花粉可以成为梨树杂交授粉的“万能”花粉。表1以‘金坠梨’做父本与供试37个梨品种授粉的田间坐果率统计
权利要求
1.一种促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于用‘金坠梨’花粉对其他梨品种进行人工授粉，均表现为授粉亲和。
2.根据权利要求1所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述的梨品种‘黄花’、‘丰水’、‘新雅’、‘新雪’、‘大水核’、‘新梨一号’、‘水晶’、‘台湾蜜梨’、‘红皮酥’、 ‘大南果’、‘胎黄梨’、‘圆香’、‘大理鸡腿’、‘灌阳雪梨’、‘冬黄’、‘鸭梨’、‘库尔勒香梨’、‘香椿’、‘晶玉’、‘苍溪雪梨’、‘红皮酥’、‘大慈梨’、‘晋蜜梨’、‘早蜜’、‘京白’、‘中梨二号’、‘奥连”、‘宝珠梨’、‘雅清’、‘早美酥’、‘满天红’、‘锦香’、‘鹅酥’、‘麦梨’、‘内蒙古山梨’、‘黄皮水’和‘政和大雪梨’，包含了目前Genebank中已登录的所有梨S-RNase基因。
3.根据权利要求1所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述的‘金坠梨’花粉通过如下方法制备采含苞待放的‘金坠梨’大铃铛花，揉搓花朵，使花药与花丝分离，用粒径为1 3mm的细孔筛筛下花药；花药在温度20 25°C、相对湿度70% 80%、 无阳光直射的室内单层摊勻，经1 2天后即可散出花粉；爆出的花粉用石蜡纸分装包好， 置于变色硅胶盒内，外用锡纸包扎整齐，冷藏或置于液氮内冷冻贮运。
4.根据权利要求3所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于在授粉前 1天，先将花粉从冷藏环境中取出，平摊在洁净的油光纸上，放入在阴暗、潮湿的环境中，经 24 48个小时左右的适应及吸潮过程，方可进行授粉；或者在授粉前1天，先将花粉从液氮冷冻环境中取出，依次在_73°C、-20°C、4°C中分别放置24小时，然后平摊在洁净的油光纸上，放入在阴暗、潮湿的环境中，经24 48个小时左右的适应及吸潮过程，方可进行授粉。
5.根据权利要求1所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述授粉的时间为所授品种的初花期，上午10点至下午4点花心柱头上有分泌粘液的时期。
6.根据权利要求5所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述的初花期为15 25%的花开放的时期。
7.根据权利要求1所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述授粉的方法为人工点授法、喷粉法或液体喷雾授粉法。
8.根据权利要求1所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述的人工点授法为将处理好的花粉与填充剂按质量比13 5的比例配好充分拌勻装入干燥的瓶中，用带橡皮头的铅笔或鹅毛耳棒沾少许花粉，轻点初开花朵，一次授3-5朵花，每个花序点授2朵边花，勿授弱花、梢头花；所述的喷粉法是将花粉与填充剂按质量比1 10 15的比例配好，经拌勻混合，装入喷粉器或授粉器中，对着盛花初期的树均勻喷布；所述的液体喷雾授粉在纯净水或蒸馏水中加入花粉、尿素、砂糖、琼脂粉、 硼砂，所述的净水或蒸馏水花粉尿素砂糖琼脂粉硼砂的质量比为 1000 2 3 50 1 1，用超低容量喷雾器喷洒。
9.根据权利要求8所述的促使梨品种间授粉完全亲和的方法，其特征在于所述的填充剂为滑石粉。
10.‘金坠梨’花粉作为“万用花粉”在梨树人工授粉中的应用。
全文摘要
本发明属于植物授粉生物学领域，公开了一种促使梨品种间授粉完全亲和的方法。该方法是利用‘金坠梨’花粉作为万能花粉对其他梨品种进行人工授粉。由于‘金坠梨’雄蕊的特异性识别功能丧失，使得它和其它任一S基因型的梨品种授粉时均能表现为杂交亲和。这一技术解决了梨树人工授粉需选择合适品种花粉的问题，并可改变目前市场上花样繁多的梨花粉供应局面，长期贮藏‘金坠梨’花粉种质，能很好的解决梨在育种过程中花期不遇或异地授粉过程中花粉的供应问题，并且该技术能进行产业化生产，有着广泛的花粉种质供应市场和良好的经济效益。
文档编号A01H1/02GK102487810SQ20111037183
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者吴俊 , 吴华清, 张绍玲, 陶书田, 齐开杰, 齐永杰 申请人:南京农业大学