专利名称：促进植物根伸长的类激素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生长激素领域，具体地，涉及一种促进植物根伸长、拮抗生长素类物质2，4-D抑制根伸长效应、拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素灯盏乙素，以及灯盏乙素在制备促进植物根伸长、在制备拮抗生长素类物质2，4_D抑制根伸长、在制备拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素中的应用。
背景技术：
灯盏乙素是短亭飞蓬中的主要活性成分，目前关于灯盏乙素的效用研究，在临床医学上主要是用于缺血性心脑血管病的治疗，此药剂具有扩张血管，改善血液微循环，降低血管阻力和抗血小板凝聚等作用(Gao et al. 2007 ；Gao et al. 2010 ；Lin et al. 2007 ；Panet al.2011)。此外，近年来还有研究表明灯盏乙素可抵御过氧化氢引起的细胞毒性(Hongand Liu 2004)，并有保护肝细胞，改善肝功能，减轻肝组织病理损害程度，防止四氯化碳诱发的肝纤维化等作用(Tan et al. 2007)，还有报道提出灯盏乙素对多种疾病的治疗都是有用的，包括失眠、抑郁、疼痛、记忆衰退等(Chen et al. 2006)。上述灯盏乙素广泛的药用途径，说明其对动物细胞有多重活性。由于植物细胞和动物细胞有很多相同的功能过程，一个对动物细胞具有多重活性的化合物，极有可能对植物细胞也发挥重要的效应。并且灯盏乙素来源于植物，它的生成对于植物的生长发育必定存在某种意义。基于上述理论认识，加之开拓植物次生代谢物生物效应的重大理论和实践意义，探索灯盏乙素在植物生理上的新用途是一项极富创新性和发展前景的工作。然而迄今为止，灯盏乙素的应用价值都体现在医学领域，而有关其在植物领域的功能和用途尚无任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以灯盏乙素为唯一活性成分的促进植物根伸长的类激素，以及提供灯盏乙素在制备促进植物根伸长的类激素中的应用。本发明所提供的促进植物根伸长的类激素灯盏乙素，来源于菊科植物短亭飞蓬，是一种重要的植物次生代谢产物，属于黄酮类化合物。本发明的另一个目的是提供一种类激素灯盏乙素，具有拮抗其他激素分子抑制根伸长效应的作用。本发明所提供的拮抗其他激素分子抑制根伸长效应的类激素灯盏乙素，能分别拮抗生长素类物质2，4-D和茉莉酸甲酯的根伸长抑制效应，而且拮抗效果是剂量依赖性的。一种促进植物根伸长的类激素，含有灯盏乙素。所述的类激素，其以灯盏乙素为唯一活性成分。所述的类激素，灯盏乙素浓度为10-400 μ M0所述的类激素，灯盏乙素浓度在10-100 μ M时促进根伸长效应随灯盏乙素浓度增
加呈增强趋势。
所述的类激素，灯盏乙素浓度在80-100 μ M时发挥最大的促进效应，使根伸长比对照组超过5倍以上。灯盏乙素在制备促进植物根伸长的类激素中的应用。一种拮抗生长素类物质2，4_D抑制根伸长效应的类激素，该类激素以灯盏乙素为唯一活性成分。所述的类激素，灯盏乙素的根伸长促进效应与2，4_D的根伸长抑制效应互相拮抗，且拮抗效果是剂量依赖性的。
所述的类激素，同时使用2，4_D和灯盏乙素，在10_9-10_4g/L2，4_D浓度范围内，100 μ M灯盏乙素促进根伸长的效应随2，4-D浓度增加呈减弱趋势，拮抗能力下降，至10_4g/L 2，4-0完全消失；当灯盏乙素浓度增至100(^1时，其对高浓度即10_/1 2，4_D拮抗能力恢复。灯盏乙素在制备拮抗生长素类物质2，4_D抑制根伸长效应的类激素中的应用。一种拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素，该类激素以灯盏乙素为唯一活性成分。所述的类激素，灯盏乙素的根伸长促进效应与茉莉酸甲酯Me-JA的根伸长抑制效应互相拮抗，且拮抗效果是剂量依赖性的。所述的类激素，同时使用Me-JA和灯盏乙素，在l-ΙΟΟμΜ Me-JA浓度范围内100 μ M灯盏乙素促进根伸长的效应随Me-JA浓度增加呈减弱趋势，拮抗能力下降，至100 μ M Me-JA完全消失；当灯盏乙素浓度从100 μΜ增至1000 μΜ时，其对I μΜ Me-JA的拮抗能力呈增强趋势。灯盏乙素在制备拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素中的应用。根是植物重要的营养器官，它是植物在长期适应陆地生活过程中发展起来的，担负着吸收水分和营养物质以及植物固着在基质上的重要作用，并且是土壤水分胁迫、盐碱、营养匮缺以及土壤病虫害等逆境胁迫的直接作用器官。根伸长生长是植物生长发育的重要阶段，多种植物激素分子都具有影响根伸长的效应，如细胞分裂素、赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯等。因而灯盏乙素对植物根伸长的影响是探索灯盏乙素在植物生理上应用的关键切入点之一 O本发明以植物次生代谢产物灯盏乙素的一种新功效，即促进植物根伸长，作为对灯盏乙素在植物领域应用的首次突破。而且灯盏乙素促进植物根伸长的作用具有激素类物质的剂量效应，并能拮抗其他两种已知具有根伸长抑制效应的激素，体现出类似于不同激素分子相互作用的模式。本发明对灯盏乙素促进植物根伸长的类激素效应的揭示，不仅为调控植物生长发育提供了新的选择，而且为灯盏乙素的应用开拓了一片全新的前景，促进了植物次生代谢产物在植物生理方面发挥生物学效应，具有重大意义。
图1-a 0-400 μ M不同浓度灯盏乙素对拟南芥根伸长的促进作用；图1-b 0-400 μ M不同浓度灯盏乙素处理拟南芥根长统计，平均值土标准差(η =25)，*表示与对照有显著差异(P < O. 05)；图2筛选灯盏乙素促进拟南芥根伸长的最适浓度，平均值土标准差(η = 10)；
图3灯盏乙素处理拟南芥后的根尖显微结构；图4100 μ M灯盏乙素与10_9_10_4g/L浓度2，4_D对拟南芥根伸长的拮抗效应(S 灯盏乙素)；
图5-a 100-1000 μ M浓度灯盏乙素与10_4g/L 2，4_D对拟南芥根伸长的拮抗效应(S:灯盏乙素)；图5-b 100-1000 μ M浓度灯盏乙素与10_4g/L 2，4_D对拟南芥根伸长拮抗效应的根长统计，平均值土标准差(η = 15或16)。*表示与对照有显著差异(P < O. 05)。(S 灯盏乙素)；图6100 μ M灯盏乙素与1-100 μ M浓度茉莉酸甲酯对拟南芥根伸长的拮抗效应；图7100-1000 μ M浓度灯盏乙素与μ M浓度茉莉酸甲酯对拟南芥根伸长的拮抗效应。
具体实施例方式下面结合附图，用本发明的实施例子来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限制本发明。下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化分子试剂公司购买得到的。实施例I :灯盏乙素的制备名称灯盏乙素/4-羟基黄芩素-7-0-葡萄糖醛酸苷(scutelIarin/ScuteIIarein 4' -methyl ether 7-glucuronide)分子式C21H18O12结构式
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OH O制备短亭飞蓬(Erigeronbreviscapus (vant)Hand Mass)药材粉碎一70% 乙醇渗漉一浓缩提取液一浓缩液过大孔树脂一50%乙醇洗脱一浓缩洗脱液一浓缩液用盐酸调PH值至1_2 —静置24小时结晶一滤晶一甲醇回流重结晶(多次)一得灯盖乙素纯品。(Ikg短亭飞蓬药材制得灯盏乙素纯品3g)实施例2 灯盏乙素对植物根伸长促进效应
一、灯盏乙素促进植物根伸长的表型分析以模式植物拟南芥野生型(Arabidopsisthaliana ecotypeColumbia, Col)为实验材料，应用滤纸培养的方法培养和处理。按实施例一中的制备方法，将所得灯盏乙素粉末溶解于呈微碱性的去离子水至终浓度为O. Olmol/L，然后用去离子水分别稀释得到10、40、100、400 μ M灯盏乙素溶液。将各浓度灯盏乙素加入6cm培养皿，每皿3mL，每个浓度5个重复(对照组则将灯盏乙素溶液换为去离子水，其他操作相同)，培养皿中铺三层滤纸，将种子均匀播种在滤纸上，于4°C冰箱黑暗春化2天，然后转移至培养室培养。培养条件为光周期 14h day/1Oh night,日温 22°C，夜温 19°C，光强 120μπιο1 ·ι -2 · s_l，湿度 45% -50%。培养一周后，从各个浓度不同重复的培养皿中随机取小苗于解剖镜下观察根形态并测量根长，每个浓度测量25株苗并统计平均根长，应用t-test校验与对照的差异显著性。实验 结果证明，10、40、100、400 μ M不同浓度灯盏乙素都能显著促进根伸长(P < O. 05)，并且在10-100 μ M浓度范围内随着乙素浓度增加其促进效应呈增强趋势，而超过100 μ M时其促进效应则呈降低趋势(图l_a，-b)。二、灯盏乙素促进植物根伸长的最适浓度筛选进一步为确定灯盏乙素促进根伸长的最适浓度，按本实施例步骤一中的培养和处理方法，分别用20、50、80、100、150、20(^1浓度灯盏乙素处理拟南芥，并按本实施例步骤一中方法取样和测量根长。结果显示80-100 μ M浓度灯盏乙素发挥最大的促进效应，此时根伸长平均比对照组超过5倍以上(图2)，因而80-100 μ M被确定为灯盏乙素促进根伸长的最适浓度。三、灯盏乙素促进根伸长的显微观察按本实施例步骤一中的培养和处理方法，用最适浓度80 μ M灯盏乙素处理拟南芥，并按本实施例步骤一中方法取样。用5 μ g/ml碘化丙唳(Propidium iodide,PI)分别对对照和灯盏乙素处理小苗根部染色5min，用去离子水清洗掉附着在根表面的多余染料，用奥林巴斯激光共聚焦扫描显微镜进行根尖结构显微观察并取图。参数设置激发光559nm，发射光580nm，物镜40 X，扫描速度25 μ m/s。结果显示灯盏乙素处理使根尖伸长区的细胞相对于对照明显增长，从而使伸长区比对照增长(图3)。由此证明灯盏乙素促进根伸长的效应主要通过促进根尖伸长区的伸长来实现。本实施例说明灯盏乙素只需微量浓度(μ M级)就能对植物根伸长发挥显著促进效应，其作用效果在一定浓度范围内随浓度增加而增强，但达到最适浓度后又逐渐下降，这些特性都符合植物激素类物质发挥功能的特性。实施例3 灯盏乙素与具有根伸长抑制效应的激素拮抗作用一、灯盏乙素与生长素类物质2，4_D对植物根伸长的拮抗效应植物的根伸长受到多种因素的控制，生长素类是具有根伸长抑制效应的植物激素之一(Pilet and Saugy 1987),其效果与实施例2步骤一中发现的灯盖乙素效果相反。按实施例2步骤一中的培养和处理方法，用100 μ M灯盏乙素依次结合10_9-10_4g/L 2,4-D处理拟南芥，并按实施例2步骤一中方法取样和测量根长。结果发现，在10_9-10_4g/L 2，4-D (生长素)浓度范围内，灯盏乙素(100μΜ)促进根伸长的效应随2，4-D浓度升高被逐渐削弱，至10_4g/L 2,4-D几乎完全抵消(图4)。而将2，4-D浓度固定为10_4g/L，依次增大灯盏乙素浓度从100 μ M至1000 μ Μ,同样的方法培养、处理、测量拟南芥。结果显示增加灯盏乙素浓度能使两种激素的结合效果朝向促进根伸长的趋势发展，当灯盏乙素增至1000 μ M其促进根伸长的效应又重新出现(图)。这说明灯盏乙素与2，4-D对植物根伸长具有拮抗效应，并且拮抗效果是剂量依赖性的。 二、灯盏乙素与茉莉酸甲酯对植物根伸长的拮抗效应茉莉酸甲酯(Me-JA)是另一种具有抑制根伸长效应的植物激素(Maciejewska andKopcewicz 2002)。按实施例2步骤一中的培养和处理方法，用100 μ M灯盏乙素依次结合1-100 μ M Me-JA处理拟南芥，并按实施例2步骤一中方法取样和测量根长。结果显示，I μ MMe-JA即可显著干扰灯盏乙素的根伸长促进效应，而100 μ M Me-JA则几乎完全抑制灯盏乙素的效应(图5)。另一方面，将Me-JA浓度固定为I μ Μ，灯盏乙素浓度依次从100 μ M增至1000 μ Μ，同样的方法培养、处理、测量拟南芥。结果显示随着灯盏乙素浓度增加，Me-JA的干扰作用明显减弱，灯盏乙素促进根伸长的效应逐渐恢复。这说明同2，4-D —样，灯盏乙素与Me-JA对植物根伸长也具有拮抗效应，而且拮抗效果也是剂量依赖性的。本实施例表明灯盏乙素与2，4-D和Me-JA两种激素对植物根伸长具有显著的相互拮抗作用，说明灯盏乙素在植物根伸长过程中具有与植物激素2，4-D和Me-JA相同重要的功能。综上所述，灯盏乙素具有促进植物根伸长的生物学效应，而且只需μ M级浓度就能发挥效应，这种极低浓度发挥生理学效应的特性与植物激素类物质一致；其次，对根伸长的促进效应在一定浓度范围内随着灯盏乙素浓度增大而增强，但当达到最大效应后继续增大浓度则对根伸长的促进作用呈下降趋势，这种发挥效应的模式与大多数植物激素低浓度促进高浓度抑制的作用模式类似；最后，灯盏乙素促进根伸长的效应能与具有根伸长抑制作用的两种植物激素2，4-D和茉莉酸甲酯互相拮抗，而且拮抗效果是剂量依赖性的，这种与其他植物激素的拮抗规律符合激素之间相互作用、相互调节的特征。所以本发明发现灯盏乙素具有促进植物根伸长的类激素效应。
权利要求
1.一种促进植物根伸长的类激素，其特征在于含有灯盏こ素。
2.根据权利要求I所述的类激素，其特征在于其以灯盏こ素为唯一活性成分。
3.根据权利要求I或2所述的类激素，其特征在于灯盏こ素浓度为10-400μ M。
4.根据权利要求I或2所述的类激素，其特征在于灯盏こ素浓度在10-100μ M时促进根伸长效应随灯盏こ素浓度增加呈增强趋势。
5.根据权利要求I或2所述的类激素，其特征在于灯盏こ素浓度在80-100μ M时发挥最大的促进效应。
6.根据权利要求3所述的类激素，其特征在于灯盏こ素浓度在10-100μ M时促进根伸长效应随灯盏こ素浓度增加呈增强趋势。
7.根据权利要求3所述的类激素，其特征在于灯盏こ素浓度在80-100μ M时发挥最大的促进效应。
8.灯盏こ素在制备促进植物根伸长的类激素中的应用。
9.ー种拮抗生长素类物质2，4-D抑制根伸长效应的类激素，其特征在于该类激素以灯盏こ素为唯一活性成分。
10.根据权利要求9所述的类激素，其特征在于灯盏こ素的根伸长促进效应与2，4-D的根伸长抑制效应互相拮抗，且拮抗效果是剂量依赖性的。
11.根据权利要求9所述的类激素，其特征在于同时使用2，4-D和灯盏こ素，在10_9-10_4g/L 2，4-D浓度范围内，100 μ M灯盏こ素促进根伸长的效应随2，4_D浓度增加呈减弱趋势，拮抗能力下降，至10_4g/L 2，4-D完全消失；当灯盏こ素浓度增至1000 μ M时，其对高浓度即10_4g/L 2，4-D拮抗能力恢复。
12.灯盏こ素在制备拮抗生长素类物质2，4-D抑制根伸长效应的类激素中的应用。
13.ー种拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素，其特征在于该类激素以灯盏こ素为ロ隹一活性成分。
14.根据权利要求13所述的类激素，其特征在于灯盏こ素的根伸长促进效应与茉莉酸甲酷Me-JA的根伸长抑制效应互相拮抗，且拮抗效果是剂量依赖性的。
15.根据权利要求13所述的类激素，其特征在于同时使用Me-JA和灯盏こ素，在1-100 μ M Me-JA浓度范围内100 μ M灯盏こ素促进根伸长的效应随Me-JA浓度增加呈减弱趋势，拮抗能力下降，至100 μ MMe-JA完全消失；当灯盏こ素浓度从100 μ M增至IOOOyM时，其对I μ M Me-JA的拮抗能力呈增强趋势。
16.灯盏こ素在制备拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素中的应用。
全文摘要
提供一种促进植物根伸长、拮抗生长素类物质2，4-D抑制根伸长效应、拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素灯盏乙素，以及灯盏乙素在制备促进植物根伸长、在制备拮抗生长素类物质2，4-D抑制根伸长、在制备拮抗茉莉酸甲酯抑制根伸长效应的类激素中的应用。首次揭示植物次生代谢产物灯盏乙素对植物根伸长的促进效应，灯盏乙素与具有根伸长抑制效应的两种植物激素2，4-D和茉莉酸甲酯互相拮抗，拮抗效果是剂量依赖性的，灯盏乙素对植物根伸长的作用是一种类激素效应。这是灯盏乙素在植物领域的首次应用，为灯盏乙素的应用展示了新领域，将推动对灯盏乙素价值的挖掘。
文档编号A01N43/16GK102613185SQ201210012269
公开日2012年8月1日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者张旭东, 李唯奇, 李艳, 陶发清 申请人:中国科学院昆明植物研究所