专利名称：月季杂交亲和性快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及植物生殖生物学领域，具体是一种月季杂交亲和性的快速鉴定方法。
背景技术：
月季(Rosa hybrida)是世界第一大观赏植物，迄今为止，全世界的月季品种已超过35000个。绝大多数月季品种都是通过长期的远缘、近缘杂交培育出来的。随着UPOV公约1991文本的实施，杂交育种将成为培育月季新品种的唯一手段。研究配组亲本的杂交亲和性对选育月季品种至关重要，尤其是育种核心种质资源的应用研究，利用远缘杂交筛选抗性品种。月季杂交亲和性受遗传亲缘关系、遗传基因、染色体倍性等方面控制或影响， 在分子育种手段研究育种资源遗传亲缘关系的基础上，田间杂交结实率是杂交亲和性最真实而直接的体现。月季的杂交不亲和性有下列表现杂交授粉时，1)花粉粒在柱头上不能萌发；2)花粉粒虽能在柱头上萌发，但花粉管却不能穿过柱头或者不能穿过花柱到达胚囊； 3)花粉管虽能到达胚囊，但它释放的精子不能和卵细胞融合形成合子，最终导致杂交不结实。在常规杂交育种过程中，只能通过观察授粉后子房是否膨大来鉴定父母本是否亲和，而这通常需要在授粉后15-20天左右才能观察到，这样不仅浪费了大量的育种资源，而且还降低育种效率，不利于高品质月季花卉产业发展。
发明内容
对杂交不亲和的品种，其在花粉管生长过程中会产生大量胼胝质，胼胝质是β -1，3 —葡聚糖，常分布于高等植物的筛管、新形成的细胞壁、花粉粒以及花粉管中，胼胝质用苯胺蓝染色后，在紫外光激发下，能够发出黄至黄绿色的荧光。由此，可把授粉后的子房用苯胺蓝染色后，放到荧光显微镜下观察，即可观察到花粉在柱头上的萌发状态、花粉管的生长状态，以及胼胝质在柱头表面的沉积状况等，以此可判断出该杂交组合是否亲和。为了能在短时间内，尽早鉴定配组亲本的杂交亲和性，确定配组杂交能否成功，减少育种资源浪费，提高育种效率，本发明提供一种月季杂交亲和性的快速鉴定方法。本发明提供的是这样一种月季杂交亲和性快速鉴定方法，其特征在于包括花粉的收集与保存步骤、去雄步骤、人工授粉步骤、待鉴定试样的切取步骤，其特征在于还包括下列步骤
Α、将切取的待鉴定试样固定于FAA固定液中，M小时后，转移到质量浓度为70%的乙醇溶液中保存；其中，所述FAA固定液为下列配比
质量浓度为37 40%的甲醛5 10 ml
质量浓度为70 %的乙醇80 90 ml
冰醋酸5 10 ml ；
B、将步骤A固定过的试样按常规用水冲洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，55 60°C水浴15 20分钟，取出，于20 下放置3 3. 5小时；
C、将步骤B的试样用自来水浸泡至少1小时，其间更换自来水3 4次，除去大部分氢氧化钠溶液，之后转移到质量浓度为0. 1%的苯胺蓝染液中染色2 3小时；
D、取步骤C的染色试样，按常规用荧光显微镜观察柱头胼胝质沉积状况，花粉萌发状态，花粉管生长状态，从而鉴定月季杂交亲和性。所述步骤A的冰醋酸为市购的分析纯产品。所述花粉的收集与保存步骤是选择生长健壮的植株，挑选待开放花朵，并挂牌标记，母本去雄，套袋，将从父本花朵上摘下的花药置于20 25°C通风处阴干，得散粉，4°C保存，待用。所述去雄步骤是选择母本植株上次日要开放的花朵进行去雄，之后套袋。这时雄蕊尚未完全发育成熟，去雄时不会散落花粉。操作时间以下午15:00 17:00为好。所述人工授粉步骤是于上午9:00-10:00，先取下母本株上的套袋，用毛笔蘸取适量散开的花粉，涂抹授粉在母本柱头上，再套袋，保持30 48小时。所述待鉴定试样的切取步骤是取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱连同子房。本发明步骤B中，用NaOH处理花柱的目的在于去除花柱组织细胞内的原生质，使花粉管不受周围花柱组织细胞遮挡，易于被染色并观察，因此，该步骤B是观察花粉管萌发的一个关键性环节，直接影响到观察的效果。当观察到试样有以下特征之一时，则鉴定为杂交不亲和 (1)未见有花粉粒萌发。(2)即便有少量花粉萌发，但生长到花柱中上部即停止生长，花粉管末端膨大，或弯曲，或变形，柱头及花粉管有大量胼胝质沉积。当观察到试样有花粉粒萌发并且有少量花粉管进入子房时，则鉴定为杂交有亲和性。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，可在较短时间内，即30 48小时， 鉴定出月季组合的杂交亲和性，从根本上解决常规杂交育种中，需要通过观察授粉后子房是否膨大，才能鉴定出父母本是否亲和，而这种观察需要等授粉后15-20天左右才能观察， 本发明方法简单，操作性强，可以尽早的鉴定配组亲本的杂交亲和性，确定配组杂交能否成功，有效减少育种资源浪费，提高育种效率。
图1为杂交亲和的花粉在柱头上的萌发； 图2为杂交亲和的花粉在柱头上的萌发；
图3为花柱中部的花粉管；
图4为杂交亲和的花粉管进入子房；
图5为图3的局部放大；
图6为杂交亲和的花粉管进入子房；
图7为杂交不亲和的柱头上没有花粉粒；
图8为杂交不亲和的柱头上有大量胼胝质沉积。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1
本实施例1中的月季指蔷薇科蔷薇属OfeM Linnaeus)中的栽培品种(cultivar)，经过下列步骤
1)花粉的收集与保存选择生长健壮的植株，挑选待开放花朵，并挂牌标记，将从父本花朵上摘下的花药置于20°C通风处阴干，得散开的花粉，4°C保存，待用；
2)去雄于下午15:00，选择母本植株上次日要开放的花朵进行去雄，之后套袋，因这时雄蕊尚未完全发育成熟，去雄时不会散落花粉；
3)人工授粉于上午9 00，先取下母本株上的套袋，用毛笔蘸取适量散开的花粉，涂抹授粉在母本柱头上，再套袋，保持30小时，并在牌上写明组合名称或代号、杂交日期、操作人姓名等信息；
4)待鉴定试样的切取取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱连同子房；
5)将步骤4)切取的待鉴定试样固定于FAA固定液中，24小时后，转移到质量浓度为 70%的乙醇溶液中保存；其中该FAA固定液为下列配比
质量浓度为37%的甲醛IOml
质量浓度为70%的乙醇80 ml
分析纯冰醋酸10 ml
6)将步骤5)固定过的试样按常规用水冲洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，55°C水浴 15分钟，取出，于20°C下放置3. 5小时；
7)将步骤6)的试样用自来水浸泡至少1小时，其间更换自来水3次，除去大部分氢氧化钠溶液，之后转移到质量浓度为0. 1%的苯胺蓝染液中染色2小时；
8)用镊子挑取一枚步骤7)的染色试样，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴上一滴甘油，盖上盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开，然后把载玻片放到LEICA DM6000 B荧光显微镜下观察，观察到柱头有花粉萌发，如图1，并且18小时后再次取样观察时有少量花粉管进入子房，如图4，说明该月季杂交有亲和性。实施例2
本实施例2中的月季指蔷薇科蔷薇属、Rosa Linnaeus)中的栽培品种(cultivar)，经过下列步骤
1)花粉的收集与保存选择生长健壮的植株，挑选待开放花朵，并挂牌标记，将从父本花朵上摘下的花药置于25°C通风处阴干，得散开的花粉，4°C保存，待用；
2)去雄于下午17:00，选择母本植株上次日要开放的花朵进行去雄，之后套袋，因这时雄蕊尚未完全发育成熟，去雄时不会散落花粉；
3)人工授粉于上午10:00，先取下母本株上的套袋，用毛笔蘸取适量散开的花粉，涂抹授粉在母本柱头上，再套袋，保持48小时，并在牌上写明组合名称或代号、杂交日期、操作人姓名等信息；
4)待鉴定试样的切取取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱连同子房；
5)将步骤4)切取的待鉴定试样固定于FAA固定液中二4小时后，转移到质量浓度为70%的乙醇溶液中保存；其中该FAA固定液为下列配比
质量浓度为40%的甲醛质量浓度为70%的乙醇分析纯冰醋酸
5 ml 90 ml 5 ml ；
6)将步骤5)固定过的试样按常规用水冲洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，60°C水浴 20分钟，取出，于下放置3小时；
7)将步骤6)的试样用自来水浸泡至少1小时，其间更换自来水4次，除去大部分氢氧化钠溶液，之后转移到质量浓度为0. 1%的苯胺蓝染液中染色3小时；
8)用镊子挑取一枚步骤7)的染色试样，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴上一滴甘油，盖上盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开，然后把载玻片放到LEICA DM6000 B荧光显微镜下观察，观察到柱头有花粉萌发，如图2，且有少量花粉管进入子房，如图6，说明该月季杂交有亲和性。 实施例3
本实施例3中的月季指蔷薇科蔷薇属、Rosa Linnaeus)中的栽培品种(cultivar)，经过下列步骤
1)花粉的收集与保存选择生长健壮的植株，挑选待开放花朵，并挂牌标记，将从父本花朵上摘下的花药置于22°C通风处阴干，得散开的花粉，4°C保存，待用；
2)去雄于下午15 30，选择母本植株上次日要开放的花朵进行去雄，之后套袋，因这时雄蕊尚未完全发育成熟，去雄时不会散落花粉；
3)人工授粉于上午9 40，先取下母本株上的套袋，用毛笔蘸取适量散开的花粉，涂抹授粉在母本柱头上，再套袋，保持38小时，并在牌上写明组合名称或代号、杂交日期、操作人姓名等信息；
4)待鉴定试样的切取取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱连同子房；
5)将步骤4)切取的待鉴定试样固定于FAA固定液中，24小时后，转移到质量浓度为 70%的乙醇溶液中保存；其中该FAA固定液为下列配比
质量浓度为38%的甲醛7 ml
质量浓度为70%的乙醇85 ml
分析纯冰醋酸8 ml ；
6)将步骤5)固定过的试样按常规用水冲洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，58°C水浴 18分钟，取出，于25 °C下放置3小时；
7)将步骤6)的试样用自来水浸泡至少1小时，其间更换自来水3次，除去大部分氢氧化钠溶液，之后转移到质量浓度为0. 1%的苯胺蓝染液中染色2小时；
8)用镊子挑取一枚步骤7)的染色试样，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴上一滴甘油，盖上盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开，然后把载玻片放到LEICA DM6000 B荧光显微镜下观察，观察到柱头上没有花粉粒，如图7，且柱头上有大量胼胝质沉积，如图8，说明该月季杂交无亲和性。
权利要求
1. 一种月季杂交亲和性快速鉴定方法，其特征在于包括花粉的收集与保存步骤、去雄步骤、人工授粉步骤、待鉴定试样的切取步骤，其特征在于还包括下列步骤A、将切取的待鉴定试样固定于FAA固定液中，M小时后，转移到质量浓度为70%的乙醇溶液中保存；其中，所述FAA固定液为下列配比B、将步骤A固定过的试样按常规用水冲洗后，置于8mol/L的NaOH溶液中，55 60°C 水浴15 20分钟，取出，于20 下放置3 3. 5小时；C、将步骤B的试样用自来水浸泡至少1小时，其间更换自来水3 4次，除去大部分氢氧化钠溶液，之后转移到质量浓度为0. 1%的苯胺蓝染液中染色2 3小时；D、取步骤C的染色试样，按常规用荧光显微镜观察柱头胼胝质沉积状况，花粉萌发状态，花粉管生长状态，从而鉴定月季杂交亲和性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A的冰醋酸为市购的分析纯产品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述花粉的收集与保存步骤是选择生长健壮的植株，挑选待开放花朵，并挂牌标记，母本去雄，套袋，将从父本花朵上摘下的花药置于 20 25°C通风处阴干，得散粉，4°C保存，待用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述去雄步骤是选择母本植株上次日要开放的花朵进行去雄，之后套袋，这时雄蕊尚未完全发育成熟，去雄时不会散落花粉，操作时间以下午15:00 17:00为好。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述人工授粉步骤是于上午9:00-10:00，先取下母本株上的套袋，用毛笔蘸取适量散开的花粉，涂抹授粉在母本柱头上，再套袋，保持 30 48小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待鉴定试样的切取步骤是取下套袋，于子房基部切下授粉后的花柱连同子房。质量浓度为37 40%的甲醛质量浓度为70%的乙醇冰醋酸.5 10 ml 80 90 ml 5 10 ml ；
全文摘要
本发明提供一种月季杂交亲和性快速鉴定方法，其特征在于包括花粉的收集与保存、去雄、人工授粉、待鉴定试样的切取等步骤，之后将切取的试样固定于FAA固定液中，24小时后转入70%的乙醇溶液中；取出水洗，置于8mol/L的NaOH溶液中，55～60℃水浴15～20分钟，于20～28℃下放置3～3.5小时；用水浸泡至少1小时，转移到0.1%的苯胺蓝染液中染色2～3小时；用荧光显微镜观察柱头胼胝质沉积、花粉萌发、花粉管生长状态，以鉴定月季杂交亲和性。可在30～48小时内，鉴定出月季组合的杂交亲和性，简单且操作性强，能有效减少育种资源浪费，提高育种效率。
文档编号A01H1/02GK102550396SQ201210040899
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者刘红明, 唐开学, 张颢, 王其刚 申请人:云南省农业科学院花卉研究所