专利名称：一种鱼类精子抗凝集保存液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于低温生物学研究领域，具体涉及一种鱼类精子抗凝集保存液及其制备方法和应用。
背景技术：
精子凝集是精子超低温冷冻过程中比较常见的一种现象，轻微的凝集可使得部分精子发生交联，限制精子的运动，严重的凝集则促使大量精子发生膜融合并呈片状、条状、团块状，且单个精子结构丧失。本专利申请的发明人董巧香等曾在对太平洋牡蛎精子超低温冻存的研究中详细的描述过这种现象(详见Qiaoxiang Dong, Changjiang Huang, et al. Control of sperm concentration is necessary for standardization of spermcryopreservation in aquatic species: Evidence from sperm agglutination inoysters. Cryobiology, 2007，54:87-98)。
董巧香等在研究如何避免超低温冷冻过程中鱼类精子发生凝聚问题时发现，在超低温冷冻过程中斑马鱼精子可释放出某种促精子凝聚的成分。因为用收集的斑马鱼冻精上清液来处理未经冷冻的斑马鱼精子，同样可使斑马鱼精子出现凝聚现象。在此基础之上，他们发现用斑马鱼冻精上清液同样可诱导其它鱼类(虎皮鱼、头尾灯)精子的凝聚，但却对人类精子不具促凝效果。为此，他们认为人类精浆可能含有某种抗凝聚的成分。因此，他们用人类精浆来处理斑马鱼精子，从而发现了人类精浆的这种抗鱼类精子凝聚的功效。他们根据多年从事鱼类低温冷冻保存的经验和对精子冷冻中膜脂含量的变化，认为鱼类精子这种冻凝特性可能源自于精子胞膜中的鞘磷脂。他们们使用鞘磷脂脂质体来处理斑马鱼精子时，发现了与低温冷冻过程所产生的相同的凝聚现象，而用其它脂类制备的脂质体则无类似的作用。因此，初步证实了是鞘磷脂诱导鱼类精子在冷冻过程中发生凝聚现象，而人类精浆却可以有效对抗这种由鞘磷脂诱导的鱼类精子凝聚。通过使用人类精浆的处理来有效对抗鱼类精子冷冻过程中凝聚的方法。目前国内外还尚未见相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鱼类精子抗凝集保存液及其制备方法和应用，以有效防止鱼类精子在超低温冷冻过程中发生凝聚，简单易行且适用于其他很多鱼类。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种鱼类精子抗凝集保存液的制备方法，包括以下步骤
1)人类精浆的获得；
2)人类精浆的纯化；
3)鱼类精子抗凝集保存液的制备。进一步地，上述步骤I)包括从健康人体获取新鲜精液，于35-40°C温箱中保存待其液化；将液化的精液分装至I. 5ml离心管(Iml/管)，然后高速离心(10000转/分离心10分钟)，吸取上层精浆(吸取的精浆体积为离心用的精液体积的1/2至2/3，避免吸取到沉淀)至1.5ml离心管中，保存备用。进一步地，上述步骤2)包括将上述步骤I)中获得的精浆于-16至-20°C冰箱中冷冻，待精浆全部冻结后取出，于室温下自然解冻，高速离心(10000转/分离心10分钟)去除析出的杂质，并按上述条件再重复冷冻、解冻、离心一次，获得含杂质更少的精浆；最后，用O. 22-0. 45 μ m滤膜过滤，获得纯化的精浆于0_4°C保存备用。进一步地，上述步骤3)包括先将纯化后的精浆与Hank’s平衡溶液以I :1至I :3的体积比混合；然后使用渗透压仪对该混合溶液的渗透压进行检测(制备完成后或使用时检测均可)，以接近该种鱼类精浆的渗透压或利于抗冻的渗透压为宜(需要添加某些非渗透性抗冻剂时，要考虑抗冻剂带来的渗透压变化以避免精子的激活或损伤)，并使用超纯水(降低)，或葡萄糖(提升)来调节渗透压至目标渗透压(淡水鱼精子保存液的渗透压应介于260-310m0s/kg之间，海水鱼精子保存液的渗透压应介于150_200m0s/kg之间)。具体使 用时只需用该保存液悬浮精子即可。本发明还提供上述方法制备的鱼类精子抗凝集保存液，以人类精浆为原料，纯化后以I :1至I :3的体积比与Hank’s平衡溶液混合制得。本发明进一步提供上述鱼类精子抗凝集保存液在防止鱼类精子凝聚中的应用。本发明产生的有益效果如下
本发明方法所制备的鱼类精子抗凝集保存液，可以有效避免由精子凝聚所引起的精子损伤，最大限度地保存每一个精子所携带的信息，减少由于精子凝聚所引起的精子受精能力的影响，降低精子凝聚所带来的精子参数分析的干扰，从而使得经历冻存的每一个精子在解冻后都可以被最大幅度地利用。
图I示出了本发明提供用于抗鱼类精子凝聚方法的技术路线 图2示出了人类精浆抗斑马鱼冷冻凝聚的效果图(A :对照组，B :人类精浆处理组)；
图3示出了鞘磷脂脂质体诱导的精子凝聚以及人类精浆抗鞘磷脂引起的精子凝聚效果(A:鞘磷脂测试液处理之前的斑马鱼精子图；B: Hank’s平衡溶液悬浮的对照组经过鞘磷脂测试液处理后的表现图；C:人类精浆处理组经鞘磷脂测试液处理后的结果图；A’ :鞘磷脂测试液处理之前的斑马鱼精子放大效果图；B’ : Hank’s平衡溶液悬浮的对照组经过鞘磷脂测试液处理后的表现放大效果图；C’ :人类精浆处理组经鞘磷脂测试液处理后的结果放大图)。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。下面结合附图作进一步说明
一种鱼类精子抗凝集保存液的制备方法(见图I)，具体实施步骤如下
一、人类精浆的获得(I)精液获取选 择身体健康的志愿者(无性病、血液传播疾病，相关病原检测为阴性)。通过手淫法取得新鲜精液，于37°c温箱中保存待其液化(30分钟后仍未液化的精液则弃去不用)。(2)分离精浆将液化的精液分装至I. 5ml离心管(lml/管)以4°C，10000转/分离心10分钟，吸取上层精浆备用(吸取的精浆体积为离心用的精液体积的1/2，避免吸取到沉淀)。二、人类精浆的纯化
(I)精浆冻融处理将取得的精浆于-20°C冰箱中冷冻，待精浆全部冻结后取出，于室温下自然解冻(注意冷冻时，需使用I. 5ml离心管分装；冷冻和解冻过程中均需保持离心管正立，并在解冻后避免摇晃离心管以避免冻融过程中所析出的杂质再溶)。(2)离心将解冻后的精浆(置于原离心管内)以4°C，10000转/分离心10分钟去除析出的杂质(注意重复执行精浆冻融、离心两步，可获得含杂质更少的精浆)。(3)过滤将离心后的精浆用O. 45 μ m聚碳酸酯滤膜过滤，获得纯化的精浆于-20°C保存备用。三、鱼类精子抗凝集保存液的制备
(I)精浆稀释将纯化后的精浆以I :2的体积比与Hank’s平衡溶液混合。(2)调整渗透压使用渗透压仪(德国G0N0TEC公司0SM0MAT_30_M型)对该混合溶液的渗透压进行检测，以接近该种鱼类精浆的渗透压或利于抗冻的渗透压为宜(需要添加某些非渗透性抗冻剂时，要考虑抗冻剂带来的渗透压变化以避免精子的激活或损伤)，通过加入超纯水(降低)，或葡萄糖(提升)来对抗凝集保护液的渗透压进行微调以调整至合适范围。(用于保存淡水鱼精子的溶液渗透压应为260-310m0s/kg，若是海水鱼类则渗透压应为150-200m0s/kg，淡水卵生鱼类一般可无需调整，在发现该保存液可激活鱼类精子时再做调整)。用该液悬浮所需冻存的鱼类精子即可达到抗凝聚的目的。以下结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。实例I、应用于冷冻所引起的精子凝聚
通常，在精子冷冻过程中应尽量避免出现精子凝聚，从而达到较好的冻存效果。因此，当精子冷冻后出现了明显的凝聚，则认为所选择的冷冻方案并不是十分适合该种精子的冻存。最为极端的情况就是不添加任何抗冻剂直接投入液氮，可引起严重的精子凝聚。而人类精浆可明显地在这种极端的情况下发挥其抗凝作用，其具体的实施步骤如下
I)人类精浆的获得
方法同上。2)人类精浆的纯化
方法同上。3)斑马鱼精子抗凝保存液的配制
方法同上。4)斑马鱼精子冷冻
斑马鱼精巢取出后于抗凝保存液中吹打施放出精子(以Hank’s平衡溶液作为对照)，调整精子浓度至IO8个/ml，分装入麦管(或冻存管)，然后直接投入液氮，待精子悬液完全冻结后取出解冻，于显微镜下观察。结果见图3，图3显示以Hank’s平衡溶液作为对照的斑马鱼精子解冻后，出现严重凝聚，保持独立的精子密度极低，而使用抗凝保存液的处理组精子高度分散，分布均匀，无凝聚现象。说明本方法可以很好地用于冷冻所引起的精子凝聚。实例2、应用于鞘磷脂所诱导的精子凝聚
本发明人已初步证实鞘磷脂会诱导鱼类精子在冷冻过程中发生凝聚，因而在非冷冻状态下于鱼类精液中加入鞘磷脂，同样会引起鱼类精子发生凝聚，但人类精浆却可对抗鞘磷脂脂质体的这种促凝作用我们采用不同鱼种进行了实验，结果见表I。表I :不同鱼类精子添加人类精浆后的抗凝效果以及对于鞘磷脂敏感性测试。
权利要求
1.一种鱼类精子抗凝集保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)人类精浆的获得； 2)人类精浆的纯化； 3)鱼类精子抗凝集保存液的制备。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)所述人类精浆获得的方法包括如下步骤从健康人体获取新鲜精液，于35-40°C的温箱中保存待其液化；将液化的精液分装至1.5ml离心管，10000转/分离心10分钟，吸取上层精浆至1.5ml离心管中，保存备用；其中所述上层精浆的体积为离心用的精液体积的1/2至2/3。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)所述人类精浆纯化方法包括如下 步骤将步骤I)中获得的人类精浆于_16°C至_20°C冰箱中冷冻，待精浆全部冻结后取出，于室温下自然解冻，10000转/分离心10分钟以去除析出的杂质，并按上述条件再重复冷冻、解冻、离心一次，获得含杂质更少的精浆；最后，用O. 22-0. 45 μ m聚碳酸酯滤膜过滤，获得纯化的精浆于0-4°C保存备用。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤3)所述鱼类精子抗凝保存液的制备包括以下步骤先将纯化后的精浆与Hank’s平衡溶液以I :1至I :3的体积比混合，然后使用渗透压仪检测该混合溶液的渗透压是否达到目标渗透压，若渗透压偏高或偏低，通过向混合溶液直接添加超纯水来降低或添加葡萄糖来提升溶液渗透压至目标渗透压。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述目标渗透压为接近所述鱼类精浆的渗透压或利于抗冻的渗透压；其中，淡水鱼精子保存液的渗透压介于260-310m0s/kg之间，海水鱼精子保存液的渗透压介于150-200m0s/kg之间。
6.一种根据权利要求1-4任一所述方法制备的鱼类精子抗凝集保存液，其特征在于，以人类精浆为原料，纯化后以I :1至I :3的体积比与Hank’s平衡溶液混合制得。
7.—种权利要求6所述鱼类精子抗凝集保存液在防止鱼类精子凝聚中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类精子抗凝集保存液及其制备方法和应用，所述方法包括以下步骤1)人类精浆的获得；2)人类精浆的纯化；3)鱼类精子抗凝保存液的制备。本发明方法所制备的鱼类精子抗凝集保存液不仅能有效对抗鱼类精子凝聚所引起的精子损伤以及对精子受精能力的影响，而且还能最大限度地保存每个精子所携带的信息以及解冻后精子最大幅度的被利用。本发明将对于珍稀鱼类种质资源的低温冷冻保存具有重大的实际意义与应用价值。
文档编号A01N1/02GK102630664SQ201210081749
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者刘静, 危林丹, 林函, 白承连, 董巧香, 陈元红, 陈将飞, 黄长江 申请人:温州医学院