专利名称：杨树糖基转移酶基因PtGT1在提高植物木质素含量及促进开花中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种杨树糖基转移酶基因在提高植物木质素含量及促进开花中的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
糖基转移酶是专门负责催化植物分子进行糖基化修饰反应的酶，它将活性糖基从核苷糖，通常是从尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖，转移到激素、次级代谢物、病原菌侵染物以及植物内外源毒性物质等一系列植物小分子化合物受体上。糖基化会改变植物小分子化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内和整体植株中的运输特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还能降低/除去内源和外源物质的毒性(Lim和Bowles 2004)。糖基转移酶具有多种功能和生物活性，其作用底物广泛，同时糖基化还能产生级联效应，因此糖基转移酶对植物分子的作用影响着植物生长发育的众多方面，例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御反应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等(Wang and Hou, 2009)。至2012年03月，按照所催化的底物的性质和序列相关性，生物界存在的糖基转移酶被划分成94个不同的家族。其中家族1包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。这个家族中的酶所催化的底物是一些亲脂性的小分子化合物，一个或多个糖基可以结合在这些分子的-0H、-C00H、-NH2、-SH或C-C基团上(Bowles等2005)。家族1中，有些酶在C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列，这一保守序列称C末端保守区或PSPG盒(plant secondary product glycosyl transferase box)。在家族 1 中具有 C 末端保守区白勺 48%左右，推测这一保守序列可能在糖基化过程中与尿嘧啶核苷二磷酸-糖(UDP-sugar)的结合有关。这些酶的N端序列变异较大，与不同底物的识别有关。杨树是一种具有重要商业价值与生态价值的木本植物。由于其基因组较小，易于转化，以及生长快速等特点，使得它成为木本植物研究中的理想模型。毛果杨基因组的公布为我们研究木本植物中的糖基转移酶基因提供了便利条件。2006年，Geisler-Lee等人预测在毛果杨中有1600多个编码碳酸化合物的基因，其中包括大概840个糖基转移酶，糖基转移酶家族1是最大并且种类最多的家族，并且在杨树中要远远多于拟南芥中的，或许是由于要参与木质部的形成等过程。目前为止，许多杨树中的糖基转移酶基因的功能已经被鉴定。例如，周功克等人在2007年从杨树中克隆了两个糖基转移酶，/ ^/ ^^/ ^/ ,属于糖基转移酶家族8和家族43，发现它们和次生壁的形成以及葡糖醛酸木聚糖的生物合成有关。尽管杨树的糖基转移酶家族1已经在基因组水平上被鉴定，但到目前为止，杨树糖基转移酶家族1基因编码序列和对植物生长发育的作用知道的很少。经检索，杨树糖基转移酶家族1的基因在提高植物木质素含量及促进开花中的应用目前未见报道。
发明内容
(1)本发明的目的
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种杨树糖基转移酶基因在提高植物木质素含量及促进开花中的应用。(2)实现本发明的具体技术方案
本发明所述杨树糖基转移酶基因PtGTl在提高植物木质素含量及促进开花中的应用。其中所述糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。所述植物是茄科植物，所述茄科植物优选是烟草、番茄或茄子。本发明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从毛白杨中克隆糖基转移酶基因，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的木质素含量得到显著提高，开花时期显著提
、r -(3)本发明实施后带来的有益效果
实验证实，应用本发明所述杨树糖基转移酶基因PtGTl进行植物转基因操作，可以显著提高植物的木质素含量(见附图2和附图3)，同时还能促使植物提前开花(见附图1)。预示本发明实施后将会创造新型植物，更好地满足工农业生产的需要。
图1.对照烟草与应用糖基转移酶基因获得的转基因烟草开花时间比较。 其中WT为对照烟草，T4和T7为转基因烟草。结果显示在相同的光照、湿度、温度等环境条件下转基因烟草比对照烟草早开花。图2.对照烟草与应用糖基转移酶基因获得的转基因烟草木质素含量比较。其中WT为对照烟草，T4和T7为转基因烟草。结果显示T4、T7两个转基因烟草株系的木质素含量明显高于对照烟草。图3.利用Wiesner染色法检测对照烟草与应用糖基转移酶基因获得的转基因烟草的木质素含量。其中WT为对照烟草，Τ4和Τ7为转基因烟草。结果显示Τ4、Τ7两个转基因烟草株系的木质素含量明显高于对照烟草。
具体实施例方式
实施例1 杨树糖基转移酶基因PtGTl的分子克隆 1.杨树糖基转移酶基因的克隆
取MS培养基上生长2-3周的杨树试管苗，利用TRIzoI试剂盒提取其RNA，RT-PCR方法扩增全长基因，获取其cDNA序列(1446bp)，所用的扩增引物为 GTl-a: 5’ -ATAGGATCCATGCAAAACACAAAACCTCA- 3’ ； GTl-b: 5’ -ATACCCGGGCTAGGCACCTTGAGCCTTTG -3，； 回收扩增的产物备用。2.杨树糖基转移酶基因的序列信息与特性分析
基因的编码区cDNA为1446bp，编码481个氨基酸构成的蛋白质，蛋白质分子量为66.4kDa。该基因没有内含子，为一个连续编码基因。序列分析发现，靠近蛋白质C端有一个由44个氨基酸组成的PSPG保守序列，该序列是植物次生代谢物糖基转移酶的共同特征，表明该基因可能编码糖基转移酶，酶的底物是植物次生代谢的小分子物质。通过ClustalX软件对毛白杨糖基转移酶基因和拟南芥中已发表的40个家族1中的糖基转移酶基因的cDNA序列进行比对，发现该基因编码的蛋白与拟南芥的UGT72E 亚家族的几个糖基转移酶相似性最高，具体讲与UGT72E1、UGT72E2、UGT72E3的相似性分别达到 75%、73% 和 73%。3.杨树糖基转移酶基因的表达分析
取在MS培养基上生长3-4周的杨树完整试管苗，分为六个部分嫩叶、老叶、上茎(茎的上部)、中茎(茎的中部)、下茎(茎的下部)和根。利用TRIzoI试剂盒分别提取它们的RNA， 应用RT-PCR方法检测毛白杨基因在不同组织种的特异性表达情况。以WSrRNA基因作为内参基因。结果表明，基因在上茎中表达最强，在其他组织部位表达较弱。
实施例2 杨树糖基转移酶基因PtGTl的转基因应用 1.含有PtGTl编码区cDNA表达载体的构建
将带有植物表达载体酶切位点的基因通过平末端连入feoRV单切的 pBluescriptSK质粒，形成中间载体pSKGTl。将测序正确的基因通过和SmaY从中间载体pSKGTl上切出。然后与feci酶切、补平以及酶切的植物表达载体pBI121进行连接，构成包含目的基因 PtGTl的植物表达载体pBIGTl。2.农杆菌介导得到植物转化
挑取含载体PBIGTl的农杆菌单菌落于YEB培养基中，内含抗生素50mg/L卡那霉素 (叙11)、501^/1利福平(财￡)，观1摇床中，200印111培养4 1左右；待菌体摇起后，转移^il 的菌体到50ml的YEB培养基中，摇床中，200rpm培养。当菌体OD6tltl为0. 6-0. 8左右时，4°C，3500rpm，离心10_15min，收集菌体。沉淀用5_10ml的MS液体培养基悬起后，离心收集，此过程重复两次。最后用25-30ml的MS液体培养基悬起，用于浸染。将上述制好的农杆菌浸染液倒入无菌培养皿中，把烟草鲜嫩叶片切成大概1平方厘米放入其中，使叶片充分接触菌液，浸染20min，期间不断轻轻摇动，利于提高浸染效率。浸染完成后，把叶片移入准备好的无菌滤纸上，充分吸去菌体液，然后移入到烟草生芽培养基(MS培养基+0. 2mg/ L IAA+2mg/L 6-BA +30g/L蔗糖+7g/L琼脂)中，封口，培养室中(25°C )，暗培养2_3天。暗培养结束后，把叶片放入MS液体培养基中，轻轻漂洗，然后用无菌滤纸吸干其上的液体，然后把叶片放入带有抗生素(500mg/L头孢霉素，100mg/L Kan)的生芽培养基中培养。培养条件25°C，每天光照16h。2-3周后，把生成的小芽移入到带有相同抗生素的生根培养基(MS 培养基+lOmg/L VB1 +0. 2mg/L NAA +30g/L蔗糖+7g/L琼脂)中培养。在生根培养基上培养2-3周后，植株大小合适，进行分子鉴定，鉴定后再移入营养土中进行生理指标等分析。3.转基因植株分子鉴定
取适当大小的转基因烟草试管苗的叶片，提取其总DNA，进行PCR验证，初步获得阳性转基因烟草株系。提取PCR验证为阳性的株系的RNA,RT-PCR方法检测表达量情况。Actin基因作为内参基因。获得高表达外源基因的两个转基因株系T4和T7。
PtGTl基因提高木质素含量和促进开花的功能验证
木质素含量的测定采用Klason方法和Wiesner染色方法。Klason木质素含量测定方法的操作是待测茎段先切成薄片，放在玻璃器皿中，放入80°C烘箱烘过夜。次日，用液氮磨成细粉后，烘干至恒重。烘干的细粉用有机溶剂甲醇抽提四次，然后用水抽提两次，放 60-70°C烘箱中过夜，烘干。称取200mg的烘干物在細1的72%的硫酸中，30°C水解Ih。水解反应完成后，用112ml的水稀释，然后在沸水浴中放置lh。沸水浴完成后，溶液过滤，用热水冲洗，至滤液不呈酸性，放入70°C的烘箱中过夜，烘干，最后称重。由测定结果可知转基因烟草株系中的木质素含量显著高于野生型烟草的木质素含量，说明基因具有提高木质素含量的作用(附图2)。Wiesner染色方法的操作是转基因烟草与野生型烟草的茎段徒手切片，置于载玻片上，先加一滴(v/v)的间苯三酚，几秒后，再加一滴6mol/L的盐酸，数秒后显色，解剖镜下观察，拍照。由染色结果可知野生型烟草木质部的染色明显浅于转基因烟草株系， 说明转基因烟草株系中的木质素含量多于野生型烟草的木质素含量(附图3)。植物开花时间的测定方法是-.PtGTl转基因烟草和普通野生型烟草的每个株系分别在培养室中培养15棵。在相同的温度，湿度等培养环境下生长。每棵烟草开花后，统计其开花所需天数。测定结果表明，在我们的培养条件下，转基因烟草通常在120天左右开花， 非转基因的对照烟草通常在70天左右开花，说明PtGTl基因具有促进植物开花的作用(附图1)。
权利要求
1.杨树糖基转移酶基因在提高植物木质素含量及促进开花中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述糖基转移酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物是茄科植物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述茄科植物是烟草、番茄或茄子。
全文摘要
本发明公开了一种杨树糖基转移酶基因PtGT1在提高植物木质素含量及促进开花中的应用，其中所述糖基转移酶基因PtGT1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其是通过RT-PCR技术从毛白杨中克隆的。本发明利用基因PtGT1构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的木质素含量得到显著提高，同时还能促使植物提前开花，预示本发明实施后将会创造新型植物，更好地满足工农业生产的需要。
文档编号A01H5/00GK102533849SQ201210081689
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者侯丙凯, 王艳文 申请人:山东大学