专利名称：真菌Fimetariella rabenhorstii A20在诱导白木香产生愈创木醇中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和农业领域，具体涉及真菌(Fimetariella rabenhorstii)A20在诱导白木香(Aquilaria sinensis (Lour. )Gilg)产生沉香组成成分愈创木醇中的应用。
背景技术：
沉香是一种名贵中药，其药用始载于《名医别录》，列为上品。其味辛、苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症(国家药典，2010)。此外，它还是一种在亚洲广受欢迎和广泛应用的传统名贵 天然香料。沉香的化学成分主要包括倍半萜类和2-(2-苯乙基)色酮类，其中倍半萜类有愈创木醇(其结构式如式I所示)、沉香螺旋醇、白木香酸、白木香醛等(Naef R，2011)。沉香是白木香树干在受到损伤或刺激的情况下分泌的一种黑色树脂，白木香(AquiIariasinensis (Lour. )Gilg))又称土沉香,属瑞香科沉香属植物,为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产沉香的唯一植物来源。目前，白木香形成沉香的具体原因和过程并不清
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I OH式I。不少研究显示，沉香属植物结香与真菌相关。自20世纪30年代，从沉香属植物结香部位分离到的真菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina)、色二孢菌(Diplodiasp.)、键刀菌(Fusarium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、裂裙菌(Schizophyllum sp.)等(张争等，2010)。目前，已有一些真菌能诱导白木香产沉香的报道。如专利“应用真菌诱导白木香树产生沉香的方法”中，涉及到真菌镰孢属Fusarium sp. A-Il和头孢霉属Cephalosporiumsp. A-17可以诱导白木香树干分泌产生黄褐色的沉香。文章“两批接菌法所产沉香挥发油化学成分的气相色谱法-质谱联用分析”(林峰等，2010)发现，白木香树干接种黄绿墨耳真菌M. fIavolivens半年、一年后，乙醚提取挥发油中有倍半職类、芳香族化合物和脂肪酸。专利“一种沉香诱导剂及其制备方法”中，提供了沉香诱导菌株可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae作为沉香诱导剂的制备方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供真菌F. rabenhorstii A20在诱导白木香产生愈创木醇中的应用。本发明通过实验发现,在白木香(Aquilaria sinensis (Lour. )Gilg)树干上接种真菌F. rabenhorstii A20,经过一段时间培养后，再对样品进行前处理并进行GC-MS分析，发现真菌F. rabenhorstiiA20能诱导白木香产生沉香组份愈创木醇。因此，本发明的第二个目的是提供一种诱导白木香产生愈创木醇的方法，其特征在于，将真菌Fimetariella rabenhorstii A20接种到白木香树干上,经过培养后，白木香能够产生愈创木醇。本发明的真菌F. rabenhorsti iA20能诱导白木香产生愈创木醇,这对剖析沉香形成机理，研究人工结香技术有重要理论和实践意义。本发明的真菌F. rabenhorstii A20属于现有技术中菌株,其公开在科技文献中陶美华、李冬利、章卫民、谭建文、魏孝义，白木香内生真菌Fimetariella rabenhorstii化学成分研究，中药材，2011，34 (02)，22广223.该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
图I是作用20天后，菌株F. rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组和两个对照组的总离子流图，其中I为菌株F. rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组；II为在PDA培养皿中培养7d的菌株F. rabenhorstii A20对照组；111为未接真菌F. rabenhorstii A20,相同处理的新鲜白木香枝条对照组；图2是作用30天后，菌株F. rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组和两个对照组的总离子流图，其中I为菌株F. rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组；II为在PDA培养皿中培养7d的菌株F. rabenhorstii A20对照组；III为未接真菌F. rabenhorstii A20,相同处理的新鲜白木香枝条对照组；图3是质谱比对图，其中I为NIST05质谱库中愈创木醇；II为实施例2和I中保留时间为21. 15，21. 20min处的样品。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :由白木香根部分离得到的内生真菌F. rabenhorstii A20保藏于4°C低温冰箱中，挑取少量保藏的斜面菌种接种到经高压灭菌的PDA平皿培养基上，28°C培养7d进行菌种活化。将白木香粗约0. 5-lcm的新鲜枝条切成约8cm左右的小段，先在0. 1%升汞溶液中浸泡5min，取出后用无菌水漂洗3次，再放入体积分数75%乙醇水溶液中浸泡5min，无菌水漂洗3次，然后用灭过菌的打孔器在白木香枝条上打孔。将打孔后白木香枝条放入有湿润无菌滤纸的平板上，用Iml无菌水冲洗真菌F. rabenhorstii A20斜面菌种，大头吸管吸取菌液注入到白木香枝条上的孔中，接种后平板用保鲜膜封口并且在黑暗、27°C环境中放置20d。将培养后的白木香枝条放入三角瓶中，加入体积分数95%乙醇水溶液浸泡过夜，提取液旋转蒸发仪蒸发至干，用I. 5ml氯仿溶解后过0. 22 y m微孔滤膜，然后将滤液进行气质联用仪分析。其中气相色谱条件为Agilent毛细管色谱柱DB-5MS (30mX0. 25mmX0. 25 u m)；色谱柱程序升温条件初始柱温60°C (保持2min)，以5°C /min升至150°C，再以1°C /min升至160°C (保持15min)，再以8°C/min升至250°C (保持20min);传输线温度250°C，载气为高纯氦气，流速l.Oml/min ;进样量I yl，程序升温汽化不分流进样，初始温度60°C，14. 5°C /min升温至250°C。质谱条件为电子轰击(EI)离子源，离子源温度230°C ;扫描质量范围(m/z) 40 500。各实验组分采用NIST05质谱库检索进行定性。同时设置未接真菌F. rabenhorstii A20,相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F. rabenhorstii A20对照组,每个实验组设置3个平行,培养物的物质提取和分析与实验组相同。结果如图I所示，从图I可以发现，将菌株F. rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组在保留时间为21. 20min处能检测到沉香组成成分愈创木醇(保留时间为21. 20min馏分的质谱图和NIST05质谱库中愈创木醇质谱比对图见图3所示，由图3说明，保留时间为21. 20min的懼分为愈创木醇),而未接真菌F. rabenhorstii A20,相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F. rabenhorstii A20对照组均为发现此组份，由此说明将真菌F. rabenhorstii A20接菌至白木香枝条,可以诱导白木香产生沉香组成成分愈创木醇。 实施例2由白木香根部分离得到的内生真菌F. rabenhorstii A20保藏于4°C低温冰箱中，挑取少量保藏的斜面菌种接种到经高压灭菌的PDA平皿培养基上，28°C培养5d进行菌种活化。将白木香粗约0. 5-lcm的新鲜枝条切成约8cm左右的小段，先在0. 1%升汞溶液中浸泡7min，取出后用无菌水漂洗4次，再放入体积分数75%乙醇水溶液中浸泡7min，无菌水漂洗4次，然后用灭过菌的打孔器在白木香枝条上打孔。将打孔后白木香枝条放入有湿润无菌滤纸的平板上，用Iml无菌水冲洗真菌F. rabenhorstii A20斜面菌种，大头吸管吸取菌液注入到白木香枝条上的孔中，接种后平板用保鲜膜封口并且在黑暗、27°C环境中放置30d。将培养后长满菌的白木香枝条放入三角瓶中，加入体积分数95%乙醇水溶液浸泡过夜，提取液旋转蒸发仪蒸发至干，用I. 5ml氯仿溶解后过0. 22 y m微孔滤膜，然后进行气质联用仪分析。其中气相色谱条件为Agilent毛细管色谱柱DB-5MS (30mX0. 25mmX0. 25 u m)；色谱柱程序升温条件初始柱温60°C (保持2min)，以5°C /min升至150°C，再以1°C /min升至160°C (保持15min)，再以8°C/min升至250°C (保持20min);传输线温度250°C，载气为高纯氦气，流速l.Oml/min ;进样量I yl，程序升温汽化不分流进样，初始温度60°C，14. 5°C/min升温至250°C。质谱条件为电子轰击(EI)离子源，离子源温度230°C ;扫描质量范围(m/z) 40 500。各实验组分采用NIST05质谱库检索进行定性。同时设置未接真菌F. rabenhorstii A20,相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F. rabenhorstii A20对照组,每个实验组设置3个平行,培养物的物质提取和分析与实验组相同。结果如图2所示，从图2可以发现将菌株F. rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组在保留时间为21. 15min处能检测到沉香组成成分愈创木醇(保留时间为21. 15min馏分的质谱图和NIST05质谱库中愈创木醇质谱比对图见图3所示，由图3说明，保留时间为21. 15min的懼分为愈创木醇),而未接真菌F. rabenhorstii A20,相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F. rabenhorstii A20对照组均为发现此组份，由此说明将真菌F. rabenhorstii A20接菌至白木香枝条,可以诱导白木香产生沉香组成成分愈创木醇。
权利要求
1.真菌Fimetariellarabenhorstii A20 在诱导白木香(Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg)产生愈创木醇中的应用。
2.—种诱导白木香产生愈创木醇的方法,其特征在于,将真菌F. rabenhorstii A20接种到白木香树干上，经过培养后，白木香能够产生愈创木醇。
全文摘要
本发明公开了一种真菌F.rabenhorstii A20在诱导白木香产生愈创木醇中的应用。本发明的真菌F.rabenhorstiiA20能诱导白木香产生愈创木醇，这对剖析沉香形成机理，研究人工结香技术有重要理论和实践意义。
文档编号A01P21/00GK102742604SQ201210167198
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者章卫民, 陶美华 申请人:广东省微生物研究所