专利名称：一种二氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法
技术领域：
本发明涉及ー种植物培养材料的消毒方法，具体说涉及ー种利用ニ氧化氯对剑麻珠芽的外植体材料的消毒方法，属于植物组织培养技术的领域。
背景技术：
近年来，植物种苗无菌培养快繁技术在农业生产上迅速发展，植物组织培养外植体材料的消毒灭菌多采用100(T2000mg/L的HgCl2 (升汞)溶液，以及次氯酸钠、过氧化氢、酒精、抗生素等，这些杀菌剂处理后很难彻底去除或效果较差，使用操作也较繁琐，工作效率低。剑麻外植体的传统消毒方法采用含有Hg2+的消毒剤，对环境和人体的毒性较大， 使用程序繁琐，工作效率低，并且初代培养增殖率低，继代周期较长，导致繁殖速度缓慢，并且因长时间继代増殖而导致繁殖体玻璃化程度显著增高，再生种苗移栽成活率低，严重阻碍剑麻快繁种苗的产量和质量提高。剑麻组培快繁为保证繁殖种苗质量而必须在短时间内建立足够数量的无菌繁殖体，因此要消毒较多的珠芽材料，杀菌剂及无菌水等用量大，成本费用高，灭菌操作工作量大。ニ氧化氯是目前国际上公认的的高效、广谱、快速、安全、无残留、不污染环境的第四代灭菌消毒剂，可杀灭一切微生物，包括细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、分枝杆菌和病毒等，且微生物不会产生抗药性。ニ氧化氯对微生物细胞壁有较强的吸附穿透能力，可有效地氧化细胞内含巯基的酶，还可快速地抑制微生物的蛋白质合成。灭菌效果比一般含氯消毒剂高2. 5倍，而且在杀菌消毒过程中对人畜等高等生物无害，无致癌、致畸、致突变性，是ー种安全、可靠的高效环保型杀菌消毒剤。在农业领域ニ氧化氯已广泛用于禽畜饲养场舍及饮水的消毒、蚕茧养殖器具消毒、鱼虾疾病防治、池水消毒与增氧、杀灭毛蚶甲肝病毒及磨菇生产灭菌消毒保鲜处理，也有用于叶菜和鲜切花采收后灭菌保鲜储存处理。但少见有关ニ氧化氯在植物无菌培养技术方面的应用。国内2006年首先报道了 ClO2对无籽西瓜种子进行表面消毒灭菌用于组培快繁研究，2009年梁钾贤等报道了用ClO2对香蕉以吸芽为材料的外植体进行消毒灭菌取得了重大成功，并在香蕉种苗生产中取得了很好的效益。到目前为止，国内外利用ClO2对剑麻外植体材料进行消毒灭菌的研究未见报道。剑麻s i sal ana Perr. ex Engelm)是一种热带多年生硬质纤维作物，其纤维色泽洁白，具有质地坚韧，拉力強，耐磨擦等众多优点，广泛应用于渔业、航海、エ矿、运输、油田等行业，以及用于编织剑麻地毯、剑麻布、过滤器、エ艺品等。剑麻综合用途广，是宝贵的热作资源。剑麻组培快繁，需要建立以珠芽茎尖分生组织为材料的无菌外植体，为保证繁殖种苗质量，必须建立足够数量的无菌外植体。因此要消毒较多的珠芽材料，杀菌剂及无菌水等用量大，成本费用高，灭菌操作工作量大。剑麻外植体的消毒通常采用1000mg/L的HgCl2溶液浸泡20min，无菌水冲洗5次，消毒剂的Hg2+对环境和人体的毒性较大，使用时需要做足防护措施，程序繁琐，工作效率低，而且初代培养增殖率低，继代周期较长。采用ClO2溶液对植物组织培养外植体材料消毒灭菌具有程序简单、环保无害、工作效率高等优点，为探讨应用ClO2建立高效、环保的剑麻外植体的消毒方法，发明人对此进行了研究。
发明内容
本发明的目的在于针对剑麻外植体传统消毒技木，消毒剂的Hg2+对环境和人体的毒性较大，使用时需要做足防护措施，程序繁琐，工作效率低，而且初代培养增殖率低，继代周期较长等问题，提供ー种具有方法程序简单、环保、高效，腋芽萌动生长快，初代繁殖系数高等特点的ニ剑麻外植体材料消毒的方法，该方法采用ニ氧化氯对剑麻珠芽外植体材料进行浸泡消毒。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
一种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，包括如下步骤
(1)剑麻外植体材料的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片备用；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为500-3000mg/L ；
(3)外植体消毒灭菌
将准备好的剑麻外植体材料移至启动工作状态的洁净工作台上，装入无菌容器中，注入新配制的活化ニ氧化氯溶液，将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，ニ氧化氯溶液浸泡消毒时间为20-50min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。ニ氧化氯灭溶液浓度和浸泡消毒时间组合的确定
采用不同浓度的ニ氧化氯溶液(3000 mg/L、2000 mg/L、1500 mg/LU000 mg/L或500mg/L)对剑麻珠芽外植体材料浸泡不同时间(20分钟、30分钟、40分钟或50分钟)组合消毒，以传统方法O. IffigCl2消毒液浸泡20分钟，无菌水冲洗5次处理做对照，接种培养后调查外植体污染率、腋芽萌生率和繁殖体最初三代増殖率作为消毒效果的评判指标。最终试验显示
1，“浓度-时间”组合为“1000 mg/L-30分钟”和“ 1500 mg/L-30分钟”的效果最好，污染率、腋芽萌生率和繁殖体最初三代増殖率的综合效果表现最佳。2.剑麻外植体材料浸泡20分钟至50分钟的消毒效果都较好，污染率均达到或超越常用的升汞溶液浸泡消毒技术水平。3. ニ氧化氯溶液浓度1000-3000mg/L处理的灭菌效果没有显著差异，500mg处理的灭菌效果与常用的升汞溶液浸泡消毒技术相当。4.浓度500mg/L的溶液处理，微生物污染率显著高于浓度1000_3000mg/L的处理，但与常用的升汞溶液浸泡消毒的微生物污染率没有显著差异，灭菌效果。5.采用浓度500_3000mg/L的ニ氧化氯消毒处理的剑麻外植体，其腋芽萌生率和繁殖体最初三代増殖率，显著高于常用的升汞消毒处理。6.采用浓度500-3000mg/L的ニ氧化氯消毒处理的剑麻外植体，其腋芽萌生率和繁殖体最初三代増殖率，随浓度升高和浸泡时间延长而有降低的趋势，浓度高、浸泡时间长，这种趋势越明显。7.采用ニ氧化氯对剑麻外植体材料浸泡消毒，省エ快捷，一次性消毒外植体材料的数量是常用的升汞消毒方法的数倍，效率非常高。8.采用ニ氧化氯对剑麻外植体材料浸泡消毒，消毒自行分解成无毒物质，操作无需采用特别防护措施，程序简单、环保。本发明的有益效果是本方法将剑麻外植体材料用ニ氧化氯消毒后浙干直接接种培养，免除了传统方法O. IffigCl2消毒液处理后必须经过无菌水冲洗5次的繁琐工作，具有方法程序简单、环保无害、工作效率高等优点，同时采用本方法消毒的外植体，在与传统 方法消毒的外植体同等培养条件下，具有腋芽萌动生长快，萌生率高，初代繁殖系数高等特点。目前国内有多家企业生产剑麻组培苗，均是因为初代増殖率低，増殖继代时间长，导致玻璃化严重，再生种苗产量低，质量差而被东南亚客商拒绝进货，经济损失巨大。本技术成果生产的剑麻组培苗受到东南亚客商的称赞。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进ー步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例I
(1)外植体材料的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片，保留I. 5cmX2cm大小的顶部生长锥；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为500mg/L ;
(3)外植体消毒灭菌
将准备好的材料移至启动工作状态的洁净工作台上装入无菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，浸泡消毒50min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，方法是将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。实施例2
(1)外植体材料的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片，保留I. 5cmX2cm大小的顶部生长锥；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为1000mg/L;
(4)外植体消毒灭菌
将准备好的材料移至启动工作状态的洁净工作台上装入无菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，浸泡消毒40min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，方法是将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。实施例3
(I)外植体材料的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片，保留I. 5cmX2cm大小的顶部生长锥。(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为1500mg/L ;
(5)外植体消毒灭菌
将准备好的材料移至启动工作状态的洁净工作台上装入无菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，浸泡消毒20min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，方法是将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。实施例4
(1)外植体材料的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片，保留I. 5cmX2cm大小的顶部生长锥；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为2000mg/L ;
(6)外植体消毒灭菌
将准备好的材料移至启动工作状态的洁净工作台上装入无菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，浸泡消毒30min后浙干消毒液，无菌水冲洗，浙干后进行外植体接种，方法是将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。实施例5
(1)外植体材料的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片，保留I. 5cmX2cm大小的顶部生长锥；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为3000mg/L ;
(7)外植体消毒灭菌
将准备好的材料移至启动工作状态的洁净工作台上装入无菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，浸泡消毒20min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，方法是将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。实施例6
(O实施外植体材料消毒的准备
选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片，保留I. 5cmX2cm大小的顶部生长锥；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为1000mg/L;
(8)外植体消毒灭菌
将准备好的材料移至启动工作状态的洁净工作台上装入无菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，浸泡消毒30min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，方法是将每个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。
权利要求
1.一种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于包括如下步骤(1)剑麻外植体材料的准备 选择剑麻的优良珠芽经培育生长有6 10片叶的植株，于睛天取回组培工作间，用水冲掉泥土和杂物后，切除根，环剥除叶片备用；(2)配制ニ氧化氯溶液按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液浓度为500-3000mg/L ；(3)外植体消毒灭菌 将准备好的剑麻外植体材料移至启动工作状态的洁净工作台上，装入无菌容器中，注入新配制的活化ニ氧化氯溶液，将材料浸没，期间更换ニ氧化氯溶液一次，对材料进行多次搅拌，ニ氧化氯溶液浸泡消毒时间为20-50min后浙干消毒液，直接进行外植体接种，将每 个材料纵切为4块，接种到剑麻诱导芽培养基中，然后移至培养室按照剑麻的组培快繁技术培养。
2.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浓度为500-1000mg/L。
3.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浓度为1000-1500mg/L。
4.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浓度为1500-2000mg/L。
5.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浓度为2000-2500mg/L。
6.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浓度为2500-3000mg/L。
7.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒时间20min。
8.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒时间30min。
9.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒时间40min。
10.根据权利要求I所述的ー种ニ氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒时间50min。
全文摘要
本发明涉及一种二氧化氯对剑麻外植体材料消毒的方法，该方法以处置好的剑麻珠芽的外植体材料，用1000-3000mg/L的二氧化氯溶液浸泡消毒20-50分钟，在启动工作状态的洁净工作台上沥干消毒液，然后将每一个珠芽材料平均分切成四块，接种到培养基上培养；本方法采用适宜浓度的二氧化氯溶液对来源于剑麻珠芽的外植体材料进行浸泡处理消毒，沥干消毒液后直接接种培养，免除了传统方法0.1%HgCl2消毒液处理后必须经过无菌水冲洗5次的繁琐工作，具有方法程序简单、环保无害、工作效率高等优点，同时采用本方法消毒的外植体，在与传统方法消毒的外植体同等培养条件下，具有腋芽萌动生长快，初代繁殖系数高等特点。
文档编号A01H4/00GK102742506SQ20121027296
公开日2012年10月24日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者刘伟清, 揭进, 梁钾贤 申请人:广东海洋大学