经济作物分生组织培养脱病毒新技术的制作方法
【专利摘要】本发明是一种可供经济作物通用的脱病毒新技术，该技术包括5个方面技术内容：建立了无菌条件下最佳脱病毒效果的分生组织细胞团(生长点)大小，一般为0.2-0.5mm，但是在显微镜下应根据植物不同而异；才能够取得最佳脱病毒效果；发现危害经济作物的病毒主要为二种，即粒状病毒和杆状病毒；经过脱病毒的试管苗需要移栽到试验田中，进行连续2-3年农艺性状特征的记载鉴定，才能确认脱病毒苗的增产效果；再进行主要化学成分测定，以保证和提高农产品的质量；建立了可供经济作物通用的生物技术脱病毒操作程序(SOP)；本发明技术达到了年生产脱病毒苗50-100万株的工厂化技术水平，脱病毒苗增产效果可以达到50％以上。
【专利说明】经济作物分生组织培养脱病毒新技术
[0001]?【技术领域】:农业生物新技术
?【背景技术】:
[0002]我国近年来经济作物发展很快。可是，经济作物很容易感染多种病毒病，尤其是以无性繁殖为主的经济作物，病毒病十分严重，感染了病毒病的经济作物叶子皱缩，生长缓慢，植株矮化，产量一年比一年低、品质差，一般减产30-80%。并逐年加重。经济效益大幅度下降，严重地阻碍了经济作物生产的发展。目前对病毒病还没有有效的农药进行防治，即使有一些农药可用，但是病毒病防治效果很差，还往往引起农药残留超标，病毒病已经成为经济作物生产的“癌症”。
[0003]为了解决经济作物广泛存在的病毒病危害问题，我们应用生物新技术，经过5年脱病毒技术研究工作，先后在薄荷，百合等系列经济作物上研究成功了高效快速脱病毒新技术:研究工作主要包括:
[0004]1.进行苏薄荷和百合的组织培养脱病毒方法技术研究，建立全套方法和技术。
[0005]2.对筛选获得的脱病毒株系进行组织培养快速繁殖，以建立各株系的克隆试管苗。
[0006]3.把脱病毒试管苗分株系移栽到试验田中，进行农艺性状特征的田间记载和产量鉴定。
[0007]4.针对经济作物的特殊性，进行化学成分测定，以保证和提高农产品的质量。
[0008]5.对经2-3年连续选育鉴定出的脱病毒彻底的优良品系进行试管苗克隆化快速繁殖，以便提供进行进一步产业化生产试种示范。
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【发明内容】
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[0009]本专利技术是经过20多年进行生物技术脱病毒的研究工作而建立起来的，应用本项目的技术，脱病毒效果可以达到90-100%，同时脱病毒薄荷，百合苗已经在生产上应用试验10年，应用试验点达到100余个，脱病毒技术已经通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定，应用本专利技术培育出来的脱毒苗在各地生产试验中均表现出明显的增产效果，增产效果达到50%左右，一般来说，薄荷，百合感病毒愈严重，应用脱病毒苗后的增产效果愈明显；本专利技术包括以下5个方面的技术内容:
[0010]1.以薄荷和百合为模式经济作物，首先进行了无菌条件下的组织培养脱病毒方法技术研究，建立全套方法和技术。薄荷和百合是典型的无性繁殖经济作物，长期的无性繁殖和连作种植，必然产生多种病毒侵染，严重影响薄荷和百合的正常生长，这也是薄荷和百合品种容易退化的主要原因之一。对于病毒病，目前尚无有效的防治措施，我们针对不同类型的经济作物，在显微镜下解剖得到不同大小茎尖分生组织，在特殊的启动培养基上进行细胞培养，然后经过细胞分裂，生长成为丛生芽，无根苗和试管苗生根四个阶段的培养过程，获得的试管苗就可以移植到苗床，培育出脱病毒大苗，进行生产鉴定和种植。
[0011]对于经过分生组织培养得到的试管苗，还需经过电子显微镜检测，确定是否已经脱去病毒，从中鉴定出完全不带病毒的植株作为繁殖材料。我们采用电镜法对薄荷，百合，草莓生姜，半夏等一系列经济作物进行了病毒病的检测。结果表明:影响经济作物产量和质量的主要病毒为:黄瓜花叶病毒(CMV)和.烟草花叶病毒检测(TMV)。
[0012]2.对筛选获得的脱病毒株系进行组织培养快速繁殖，以建立各株系的克隆试管苗。
[0013]对经过脱病毒工作后获得的材料，每个样品材料均在20个视野进行病毒检查。对未观察到了任何杆状病毒粒子，(TMV);也没有发现球状病毒(CMV);的材料，我们作为优质脱毒苗进行了加速繁殖和进一步田间鉴定。
[0014]3.把脱病毒试管苗分株系移栽到试验田中，进行农艺性状特征的田间记载和产量鉴定。
[0015]植株农艺性状的鉴定:采取定株观测的方法，每株系选取20株，于七月中下旬采收期对其株高、叶长、叶宽、茎粗、节数、分枝数、基部长度进行了测定。叶面积用第10对叶宽和叶长的乘积表示，并用螺旋测微器测量该处的茎粗。基部长度选取地面上5节测量。分别计算其平均值。对脱毒和未脱毒百合的田间农艺性状也同样进行了类似的观察与测定。与未脱毒百合相比，脱毒菊鳞茎直径明显增加，植株高大，叶片宽厚。明显显示出较强的生长优势。
[0016]4.针对经济作物的特殊性，进行化学成分测定，以保证和提高农产品的质量。
[0017]我们分别对薄荷和百合进行了主要化学成分的测定和分析；在薄荷化学成分测定中，我们对各株系挥发油含量，薄荷醇含量的质量指标进行了测定七月中下旬当植株普遍现蕾，开花10%左右(花开至3轮)时，选天气连续晴5~7d后晴天上午露水干后开始收害I]，将收割的薄荷阴干，切去下面无叶老茎，按《中国药典》(2000版)附录XI挥发油测定方法提取挥发油，读取毫升数。 挥发油含量以每克鲜草毫升数计。
[0018]进行了百合多倍体试管苗和脱病毒试管苗及百合未脱毒试管苗的生物碱和多糖的含量测定，实验结果表明脱病毒试管苗的总糖及生物碱含量均高于未脱毒试管苗，为选育优良品种提供了依据。综合百合生物碱和多糖含量的测定结果，筛选出6个生长势强，生物碱含量高的脱病毒品系作为今后进一步生产应用的优良株系。
[0019]5.对经2-3年连续选育鉴定出的脱病毒优良品系进行试管苗克隆化快速繁殖，提供进行进一步产业化生产试种示范。脱病毒试管苗培育成功后，还需要解决快速繁殖(克隆化)的问题，才能在生产上应用推广，为此我们在培养基试验中，进行了一系列培养基的优化试验，经过多年试验，分别得到了百合，薄荷等系列经济作物的最佳丛生芽繁殖培养基配方，最佳生长培养基配方，试管苗生根培养基配方，应用该系列培养基配方，可以达到年生产脱病毒薄荷，百合苗50-100万株的技术水平，完全可以满足脱毒薄荷，百合大面积生产中对脱病毒试管苗的大量需求。
?【专利附图】
【附图说明】:
[0020]图1是主要病毒之一粒状病毒的电子显微镜照片的图；
[0021]图2是主要病毒之二杆状病毒的电子显微镜照片的图；
[0022]图3是大量脱病毒试管苗在实验室培育照片的图；
[0023]图4是产量高，生长健壮的脱毒薄荷苗(无病毒薄荷)的图；[0024]图5是经过生物技术脱病毒后生产出来的百合产品的图；
图6是高产，优质的脱病毒百合商品的图。
?【具体实施方式】:
[0025]本专利的技术流程:
[0026]1.采集薄荷，百合等经济作物优良品种的感病毒材料(芽或者鳞茎)
[0027]2.将芽或者鳞茎作为外植体洗净，置于流水冲洗10分钟。
[0028]3.小心剥去外部叶片或者鳞片3-5张，取出中心芽。
[0029]4.对有病毒的薄荷，百合芽进行高温短时预处理(40_50°C 5-20分钟)。以杀死或者钝化部分病毒。
[0030]5.对薄剥去外部叶片的芽先后用0.1 %氯化汞，2%次氯酸钠消毒10分钟。
[0031]6.将无菌状态的薄荷，百合芽，置于体视显微镜下，进行无菌解剖。取出02-0.5mm的分生组织(生长点)其中薄荷以0.2-0.4毫米为宜，百合以0.3-0.5毫米为宜。
[0032]7.在无菌条件下，将生长点置于最优化的细胞启动培养基上进行启动培养40天，(MS+BA0.5-2.0ppm+IAA0.1-0.2ppm)。获得无病毒愈伤组织。
[0033]8.在无菌条件下，将无病毒愈伤组织转移到繁殖培养基上，培养30天获得大量丛生芽。
[0034]9.在无菌条件下，将获得大量丛生芽转移到生长培养基上，经过30天的培养，丛生芽生长成为无根试管苗。
[0035]10.在无菌条件下，将无根试管苗转移到生根培养基上培养20天，生长成为可以移栽的有根试管苗。
[0036]11.将脱病毒试管苗移植到育苗苗床，经过1-2月的培育，培育成为脱毒原种苗。
[0037]12.经过脱病毒的原种苗移栽繁殖田中进行自然条件下的繁殖，经过2-3月的田间繁殖就可以繁殖出20-30倍的脱病毒大苗。
[0038]13.将脱病毒大苗移植到试验田中，进行连续2-3年农艺性状特征的田间记载鉴定。确认了脱病毒苗的明显增产效果。
[0039]14.针对经济作物的特殊品质要求，进行了主要化学成分测定，以保证和提高农产品的质量。
[0040]15.对于经过产量，质量鉴定确定为高产优质的脱病毒苗，进一步进行实验室组织培养克隆化快速繁殖，在本专利技术工艺条件下，脱病毒试管苗的繁殖可以达到每年50-100万倍的繁殖速度，完全可以满足今后大面积产业化生产对脱病毒苗的大量需求，达到大面积推广应用脱病毒苗的要求。提供进行生产示范推广和应用。
【权利要求】
1.应用生物新技术，进行分生组织细胞培养脱病毒新技术的研究，以经济作物--苏薄荷和百合为模式研究对象，建立了最佳生长点大小(0.2-0.6毫米)，最佳脱病毒效果的新技术，建立了全套方法和可供开发应用的程序。
2.通过多年经济作物脱病毒试验研究，发现经济作物中存在的病毒病主要为二种，即粒状病毒好杆状病毒。
3.针对经济作物的特殊品质要求，分别优化建立了薄荷和百合主要化学成分-薄荷醇，百合多糖的快速测定方法，以保证和提高农产品的质量。
4. 为了满足生产上对脱病毒优质种苗的大量需求，对选育鉴定出的脱病毒优良种苗，建立了试管苗克隆化快速繁殖技术，培养基配方，和试管苗最佳育苗技术，达到了每年可生产50-100万试管苗的工厂化育苗的工艺技术水平。
【文档编号】A01H4/00GK103563743SQ201210277951
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】高敏, 高山林 申请人:高山林, 高敏