专利名称：一种马的非手术胚胎移植方法
技术领域：
本发明涉及胚胎移植技术领域，特别涉及一种马的非手术胚胎移植方法。
背景技术：
胚胎移植技术是一项应用于哺乳动物的繁育高新技术。利用胚胎移植，可以开发遗传特性优良的母畜繁殖潜力，较快地扩大良种畜群，在自然情况下，牛、马等母畜通常一年产I胎，一生繁殖后代仅仅16只左右；猪也不过百头。采用胚胎移植则使优良母畜免去 了冗长的妊娠期，胚胎取出后不久即可再次发情、配种和受精，从而能在一定时间内产生较多的后代。目前在许多畜牧业发达国家胚胎移植均已进入产业化发展阶段。在我国，这一技术起步较晚，我国从七十年代开始对胚胎生物工程技术进行研究，八十年代后发展迅速。先后采用胚胎移植技术成功对奶牛、波尔山羊进行扩繁。由于各种原因，建国以来我国养马业日渐消退，因此国内马的胚胎移植技术也鲜有研究。但是随着现代马术运动的兴起，我国养马业开始复苏，应用胚胎移植技术进行良种马匹的扩繁成为改良我国马匹品种以适应现代马术运动的一条捷径。由于马属动物的卵巢结构有其独特性，因此导致了马属动物的生理特点及排卵规律有别于其他动物。虽然牛羊等胚胎移植技术已经成熟化，但并不适用于马属动物。
发明内容
为了提高进口良种马匹的繁育能力，本发明实施例提供了一种马的非手术胚胎移植方法。为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马的非手术胚胎移植方法，其中，所述移植方法包括以下步骤
检胚步骤将含有胚胎的胚胎混合液，在无菌操作台内的体视显微镜下按照从左到右、从上到下的“S”路线逐格进行检查，直至找到适合移植的胚胎；
洗胚步骤将检胚步骤找到的胚胎放入装有胚胎营养液的多孔培养板中，体视显微镜下逐孔洗胚，共洗6 10次；
装胚步骤在无菌操作台内的体视显微镜下将胚胎按照液体-气体-液体-胚胎-液体-气体-液体的顺序装入移胚管，备用。
所述检胚步骤之前还可以进一步包括备胚步骤，所述备胚步骤为于供体母马排卵后6^8天使用Y型管冲胚装置进行冲胚获得包含胚胎和冲胚液的胚胎混合液，或者准备好通过体外受精方式获得的含有胚胎和培养液的胚胎混合液。所述备胚步骤之前还可以进一步包括排卵调控步骤，所述排卵调控步骤为于供体母马和/或受体母马发情期、卵泡直径> 35mm时静脉注射hCG，使用剂量为1200-1800单位/匹O
所述备胚步骤之前还可以进一步包括发情调控步骤，所述发情调控步骤为于供体母马和/或受体母马黄体生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用剂量为O. 15-0. 3mg/匹。
所述装胚步骤之后还可以进一步包括移植步骤，所述移植步骤为将装好胚胎的移植管放入胚胎移植枪内，清洗并擦干受体母马外阴后，将移植枪送入母马子宫内，插入移植枪内芯，将胚胎送入受体母马子宫。
所述备胚步骤中的所述Y形管冲胚装置包括Y型管、带气囊导管和集卵杯，所述Y型管·的一端连接所述带气囊导管，用于通过所述Y型管向供体母马子宫内灌注冲胚液，或者通过所述Y型管向所述集卵杯内输送胚胎或混有胚胎的混合液；所述Y型管的另一端带有集卵控制开关，连接有所述集卵杯；所述Y型管的第三端带有冲胚控制开关，连接盛放冲胚液的容器。
所述洗胚步骤中的所述胚胎营养液包含以下成分氯化钠6 10g/L，氯化钾O. Γ0. 3g/L，磷酸氢二钠f I. 5 g/L，磷酸二氢钾O. f0. 3 g/L，氯化钙O. 05、. 15 g/L，氯化镁0.05、. 15 g/L，体积百分比为O. 3、. 6%的牛血清白蛋白或体积百分比为1% 10%的犊牛血清，青霉素9(Γ110万单位/升，链霉素5(Γ100万单位/升。
所述洗胚步骤中的所述多孔培养板优选为8孔培养板，且体视显微镜下逐孔洗胚，共洗7次。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是本发明实施时选择进口优良马匹作为供体母马，选择国产母马作为受体母马，根据母马生理特点、排卵规律，采用非手术法进行冲胚、体视显微镜下检胚以及洗胚，并采用非手术法将胚胎移植给生理周期同步的受体母马；还可以采用人工干预的方式对供受体母马进行发情调控、排卵调控。本发明可使每匹供体母马年产有效胚胎6 12枚，鲜胚移植成功率可达85%，本发明不需要麻醉和手术，极大地提高了供受体母马的利用率。检胚时，按照从左到右、从上到下的“S”路线逐格进行检查，能够全面彻底的把所有胚胎找到，并利于判断哪个或哪些是适合移植的胚胎；装胚时，将胚胎按照液体-气体-液体-胚胎-液体-气体-液体的顺序装入移胚管，能够使胚胎始终处于液体中间，不会向两侧滑落而造成胚胎丢失。
具体实施例方式为了提高进口良种马匹的繁育能力，使进口良种马匹可年产胚胎6-12枚，从而达到快速繁育进口优良马种以适应现代马术运动的需要的目的，本发明提供了一种马的非手术胚胎移植方法。
实施例I:
一种马的非手术胚胎移植方法，移植方法包括以下步骤
备胚步骤准备好通过体外受精方式获得的含有胚胎和培养液的胚胎混合液。检胚步骤将含有胚胎的胚胎混合液，在无菌操作台内的体视显微镜下按照从左到右、从上到下的“S”路线逐格进行检查，直至找到适合移植的胚胎；
洗胚步骤将检胚步骤找到的胚胎放入装有胚胎营养液的8孔培养板中，体视显微镜下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液体留作装胚用；
装胚步骤在无菌操作台内的体视显微镜下将胚胎按照液体-气体-液体-胚胎-液体-气体-液体的顺序装入移胚管，备用。其中，洗胚步骤中的胚胎营养液包含以下成分氯化钠8g/L，氯化钾O. 2 g/L，磷酸氢二钠I. 2 g/L，磷酸二氢钾O. 15 g/L，氯化钙O. 12 8/1，氯化镁0.08 g/L，体积百分比为O. 4 %的牛血清白蛋白，青霉素100万单位/升，链霉素80万单位/升。
实施例2
一种马的非手术胚胎移植方法，移植方法包括以下步骤
备胚步骤于供体母马排卵后61天使用Y型管冲胚装置进行冲胚获得包含胚胎和冲胚液的胚胎混合液。检胚步骤将含有胚胎的胚胎混合液，在无菌操作台内的体视显微镜下按照从左到右、从上到下的“S”路线逐格进行检查，直至找到适合移植的胚胎；
洗胚步骤将检胚步骤找到的胚胎放入装有胚胎营养液的8孔培养板中，体视显微镜下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液体留作装胚用；
装胚步骤在无菌操作台内的体视显微镜下将胚胎按照液体-气体-液体-胚胎-液体-气体-液体的顺序装入移胚管，备用。移植步骤将装好胚胎的移植管放入胚胎移植枪内，清洗并擦干受体母马外阴后，将移植枪送入母马子宫内，插入移植枪内芯，将胚胎送入受体母马子宫。其中，备胚步骤中的Y形管冲胚装置包括Y型管、带气囊导管和集卵杯，Y型管的一端连接带气囊导管，用于通过Y型管向供体母马子宫内灌注冲胚液，或者通过Y型管向集卵杯内输送胚胎或混有胚胎的混合液；Y型管的另一端带有集卵控制开关，连接集卵杯；￥型管的第三端带有冲胚控制开关，连接盛放冲胚液的容器。其中，洗胚步骤中的胚胎营养液包含以下成分氯化钠10g/L，氯化钾O. 3 g/L，磷酸氢二钠I. 35g/L，磷酸二氢钾O. 2g/L，氯化钙O. 08g/L,氯化镁O. I g/L,体积百分比为6%的犊牛血清，青霉素110万单位/升，链霉素60万单位/升。
实施例3
一种马的非手术胚胎移植方法，移植方法包括以下步骤
发情调控步骤为于黄体生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用剂量为O. 2mg/匹。使用PGF2 α后I 3天母马即可进入发情期。
排卵调控步骤为于母马发情期、卵泡直径> 35mm时静脉注射hCG，使用剂量为1500单位/匹。使用hCG后24 48小时母马即可完成排卵。备胚步骤于供体母马排卵后61天使用Y型管冲胚装置进行冲胚获得包含胚胎和冲胚液的胚胎混合液。检胚步骤将含有胚胎的胚胎混合液，在无菌操作台内的体视显微镜下按照从左到右、从上到下的“S”路线逐格进行检查，直至找到适合移植的胚胎；
洗胚步骤将检胚步骤找到的胚胎放入装有胚胎营养液的8孔培养板中，体视显微镜下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液体留作装胚用；
装胚步骤在无菌操作台内的体视显微镜下将胚胎按照液体-气体-液体-胚胎-液体-气体-液体的顺序装入移胚管，备用。
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移植步骤将装好胚胎的移植管放入胚胎移植枪内，清洗并擦干受体母马外阴后，将移植枪送入母马子宫内，插入移植枪内芯，将胚胎送入受体母马子宫。其中，备胚步骤中的Y形管冲胚装置包括Y型管、带气囊导管和集卵杯，Y型管的一端连接带气囊导管，用于通过Y型管向供体母马子宫内灌注冲胚液，或者通过Y型管向集卵杯内输送胚胎或混有胚胎的混合液；Y型管的另一端带有集卵控制开关，连接集卵杯；￥型管的第三端带有冲胚控制开关，连接盛放冲胚液的容器。其中，洗胚步骤中的胚胎营养液包含以下成分氯化钠10g/L，氯化钾O. 3 g/L，磷酸氢二钠I. 35g/L，磷酸二氢钾O. 2g/L，氯化钙O. 08g/L,氯化镁O. I g/L,体积百分比为6%的犊牛血清，青霉素110万单位/升，链霉素60万单位/升。
移植试验
种公马欧洲进口良种温血马4匹。供体母马欧洲进口良种温血马10匹。受体母马国产母马120匹。试验时间及移植方法采用本发明实施例3的移植方法进行移植试验。移植数量按月统计。实验地点青岛即墨鳌山卫马匹繁育基地。试验数据见表I。表I每月移植数量和怀孕数量统计表
—|3月|4月|5月 |6月|7月|8月|9月|10月
移植数28~ 12 ~ 15了4Ti125
怀孕数26~ 10 ~ 13了312114
移植成功率1100%175% 183. 3% |86. 7%\92. 9%|80% |91. 7%丨80%
由表I能够看到，通过本发明实施例3的移植方法进行胚胎移植，能够大大提高进口良种马匹的繁育能力，每匹每年能成功产胎6-12枚,移植成功率平均为86. 2%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述移植方法包括以下步骤 检胚步骤将含有胚胎的胚胎混合液，在无菌操作台内的体视显微镜下按照从左到右、从上到下的“S”路线逐格进行检查，直至找到适合移植的胚胎； 洗胚步骤将检胚步骤找到的胚胎放入装有胚胎营养液的多孔培养板中，体视显微镜下逐孔洗胚，共洗6 10次； 装胚步骤在无菌操作台内的体视显微镜下将胚胎按照液体-气体-液体-胚胎-液体-气体-液体的顺序装入移胚管，备用。
2.根据权利要求I所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述检胚步骤之前还可以进一步包括备胚步骤，所述备胚步骤为于供体母马排卵后61天使用Y型管冲胚装置进行冲胚获得包含胚胎和冲胚液的胚胎混合液，或者准备好通过体外受精方式获得的含有胚胎和培养液的胚胎混合液。
3.根据权利要求2所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述备胚步骤之前还可以进一步包括排卵调控步骤，所述排卵调控步骤为于供体母马和/或受体母马发情期、卵泡直径≥35mm时静脉注射hCG，使用剂量为1200-1800单位/匹。
4.根据权利要求3所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述备胚步骤之前还可以进一步包括发情调控步骤，所述发情调控步骤为于供体母马和/或受体母马黄体生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用剂量为O. 15-0. 3mg/匹。
5.根据权利要求I一4任一所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述装胚步骤之后还可以进一步包括移植步骤，所述移植步骤为将装好胚胎的移植管放入胚胎移植枪内，清洗并擦干受体母马外阴后，将移植枪送入母马子宫内，插入移植枪内芯，将胚胎送入受体母马子宫。
6.根据权利要求I一5任一所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述备胚步骤中的所述Y形管冲胚装置包括Y型管、带气囊导管和集卵杯，所述Y型管的一端连接所述带气囊导管，用于通过所述Y型管向供体母马子宫内灌注冲胚液，或者通过所述Y型管向所述集卵杯内输送胚胎或混有胚胎的混合液；所述Y型管的另一端带有集卵控制开关，连接有所述集卵杯；所述Y型管的第三端带有冲胚控制开关，连接盛放冲胚液的容器。
7.根据权利要求I一6任一所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述洗胚步骤中的所述胚胎营养液包含以下成分氯化钠6 10g/L，氯化钾O. Γ0. 3 g/L，磷酸氢二钠Γ1. 5 g/L，磷酸二氢钾 O. Γ0. 3 g/L，氯化钙 O. 05、. 15 g/L，氯化镁 O. 05、. 15 g/L，体积百分比为O. 3、. 6%的牛血清白蛋白或体积百分比为1% 10%的犊牛血清，青霉素9(Γ110万单位/升，链霉素5(Γ100万单位/升。
8.根据权利要求I一7任一所述的马的非手术胚胎移植方法，其特征在于，所述洗胚步骤中的所述多孔培养板为8孔培养板，且体视显微镜下逐孔洗胚，共洗7次。
全文摘要
本发明公开了一种马的非手术胚胎移植方法，移植方法包括以下步骤发情调控步骤；排卵调控步骤；备胚步骤；检胚步骤；洗胚步骤；装胚步骤；移植步骤。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是本发明实施时选择进口优良马匹作为供体母马，选择国产母马作为受体母马，根据母马生理特点、排卵规律，采用非手术法进行冲胚、体视显微镜下检胚以及洗胚，并采用非手术法将胚胎移植给生理周期同步的受体母马；还可以采用人工干预的方式对供受体母马进行发情调控、排卵调控。本发明可使每匹供体母马年产有效胚胎6~12枚，鲜胚移植成功率可达85%，本发明不需要麻醉和手术，极大地提高了供受体母马的利用率。
文档编号A61D19/04GK102836014SQ20121032923
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者张志鹏, 荣美洁, 李成修, 邢金凤, 张肖军 申请人:青岛德瑞骏发生物科技有限公司