专利名称：防治蓝莓枯萎病的生防菌株kmxu1及其生防菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及防治蓝莓枯萎病的生防菌株KMXYl及其生防菌剂，属生物农药技术领域。
背景技术：
蓝莓(Vaccinium spp.)，是一类属于杜胃$花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)的多年生小浆果类果树，广泛地应用于医药、保健、化妆品和环境保护等各方面，联合国粮农组织将其果实列为人类世界五大健康食品之一 [1，2]，也是南方酸性土丘陵地区值得发展的经济作物。据统计，到2008年，全国超过 10个省份开始了大面积的商业化栽培，总栽培面积由2000年的24 hm2快速发展到2000余hm2，预计未来10年内将超过10万hm2[3]。但是随着生产面积的不断扩大，蓝莓病害也日趋严重，严重影响和制约蓝莓产业的发展。蓝莓枯萎病主要通过根部或枝条伤口侵入导致整个蓝莓植株或个别枝条迅速死亡，调查发现，该病发病率通常在10% 15%，重者可达25%以上，引起蓝莓整株枯萎，造成严重损失。引起蓝莓枯萎病的病原菌一葡萄座腔菌属(BotryosphaeriaCes. &De Not.)是一类世界性分布的真菌，所导致的树木溃疡病是世界范围内发生的重大病害°其中，由B. dothidea (Moug. :Fr. ) Ces. & de Not (anamorph Fusicoccum aesculiCorda.)危害的寄主最多，达45个属(阔叶树40个属、针叶树5个属)，对林果木危害严重，可引起桉树(Eucalyptus)、杨树(Populus)、苹果(Malus)、石槽(Catunaregam)、桃树(Prunua)、草决明(Cassiatora)、杨梅(Myrica rubra)、板栗(Castaneamollissima)等寄主植物的枝干溃疡枯萎死亡、干腐、流胶等症状[4-8]。在我国蓝莓(Vaccinium spp.)近年作为一种新兴小衆果果树被大量种植,也是南方酸性土丘陵地区值得发展的经济作物。蓝莓枯萎病及其它蓝莓病害随着大规模商业化种植也日趋严重。Creswell and Milholland (1987)报道1985年在美国北卡罗莱纳州东南部蓝莓种植区的蓝莓枯萎病发病率为23%，是该地区蓝莓种植中的主要病害，高丛(Highbush Blueberries)和兔眼(Rabbiteye blueberry)蓝莓品种为易感品种,特别是仅种植1-2年的植株损失最为严重[9，10]。我们前期通过田间调查也发现，部分种植区该病发病率通常在10% 15%，重者可达25%以上。近几年，在韩国(Korea)，新西兰(New Zealand)，智利(Chile)等国家或地区也有该病害的报道[11_13]。化学农业对农田生态系统的严重破坏，病原菌对药剂的抗性也越来越明显，同时化学农药不易降解，高残留，对人畜不安全等都严重限制了将来在农业生产上的应用，特别是蓝莓这一类高附加值的浆果类水果。因此，非化学类防治措施目前已经成为防治蓝莓枯萎病及土传病害的核心方式，而生物防治则为最有前途的方法。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。参考文献[I]李亚东，张志东，吴林.蓝莓果实的成分及保健机能.中国食物与营养，2002， (I): 27-28.
[2]陈卫.蓝莓及其营养保健功能.中外食品，2003，(7): 34-35.[3]苏宝玲，陈薇，范业展，等.越橘病害概述北方园艺，2010，(6):218-223.[4] Yu Lj Chen X L, Gao L L, et al. First report of Botryosphaeriadothidea causing canker and shoot blight of eucalyptus in China. Plant Disease,2009，93:7，764.3-764.3.[5] Far D F，Elliott M，Rossman AY, et al. Fusicoccum arbuti sp.nov. causing cankers on Pacific madrone in western North America with noteson Fusicoccum dimidiatum， the correct name for Scytalidium dimidiatum andNattrassia mangiferae. Mycologia, 2005，97(3): 730-741.[6] Smith D R， Stanosz G R. Molecular and morphological differentiation of Botryosphaeria dothidea (anamorph Fusicoccum aesculi) from some other fungiwith Fusicoccum anamorphs. Mycologia, 2001，93(3): 505-515.[7] Zhou S, Stanosz G R. Primers for amplification of mt SSU rDNA,and a phylogenetic study of Botryosphaeria and associated anamorphic fung1.Mycological Research, 2001，105 (9):1033-1044.[8] Slippers B，Crous P W, Denman S，et al. Combined multiple genegenealogies and phenotypic characters differentiate several species previouslyidentified as Botryosphaeria dothidea. Mycologia, 2004， 96: 83-101[9] Cline W 0. Predicting blueberry stem blight in new plantings. ActaHortj 1997， 446:421-426.[10] Creswell T C, Milholland R D. Responses of blueberry genotypes toinfection by Botryosphaeria. dothidea. Plant Disease, 1987, 71:710-713.[11] Choi I Y. First report of bark dieback on blueberry caused byBotryosphaeria dothidea in Korea. Plant disease, 2011, 95 (2):227.1 - 227.1.[12] Johnston P R, Mckenzie E H C. Blueberry diseases In New ZealandNew Zealand Journal of Experimental Agriculture, 1982, 10: 73-77.[13] Espinoza J G, Briceno E X, Chavez E R, et al. Neofusicoccum spp.associated with stem canker and dieback of blueberry in Chile. Plant Disease,2009， 93:1187-119
发明内容
本发明的目的在于针对目前农业生产中蓝莓枯萎病防治在有机栽培中难度大、成本高，不宜使用化学农药和农药残留高的问题，提供一种防治蓝莓枯萎病的生防菌株KMXYl及其生防菌剂。本发明从云南省曲靖市富源县蓝莓种植区蓝莓根际土壤中分离得到菌株KMXY1，对其鉴定结果表明该细菌属于解淀粉芽孢杆菌，该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) KMXYl。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期2012年9月21 ;保藏号CGMCC NO. 6598。本发明的菌体特征及菌落特征菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。本发明的生防菌剂经如下步骤得到a.将菌株KMXUl移植到试管中进行一环活化，28°C培养48小时；试管中的PSA培养基为称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g普通蔗糖糖和17g琼脂，溶解后趁热纱布过滤，15磅温度为121 °C的蒸气灭菌20分钟；b.取一环活化后的菌苔移入用IOOOml锥形瓶装的600ml配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0的LB培养液中，在120转/min、28 °C下培养72小时，获得发酵菌液； c.将发酵菌液按接种量1:200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度29-31°C，发酵16-18小时后，获得发酵用菌种；d.将发酵用菌种按接种量1:20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为29-31°C，发酵72-96小时，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85-90%，酸碱度为6. 5 7. 5时，储存作为生防菌液；e.将生防菌液5000rpm离心6 min,取离心后的菌体与保藏液按1:50 g/ml配成活性菌剂，成品中活菌总浓度为2X IO10 2X1011 CFU/ml ;菌体保藏液为:0. 015mol/L磷酸盐缓冲液(常用的用于生物学研究的一种缓冲溶液，组成成分磷酸二氢钾34g，lmol/L氢氧化钠溶液175ml,蒸懼水825ml, PH7. 2)。本发明所用的设备均为市场销售的通用设备。本发明的优点在于1、本发明的生防菌剂制作容易且成本低，无毒、无害、无环境污染，蓝莓小浆果产业的有机栽培，保护农田生态系统，实施农业的可持续发展；该菌剂还具有促生增产作用，有利于改良蓝莓种植土壤，增加土壤中的微生物活性。2、平板拮抗实验表明KMXY1菌剂对蓝莓枯萎病菌和相关植物病原真菌具有明显的抑制作用。4、温室小区试验结果显示=KMXYl菌剂能有效控制蓝莓枯萎病菌对蓝莓植株的侵染，抑制病原菌菌丝的生长，达到控制枯萎病病情发生的效果。另外，KMXYl菌剂能有效促进蓝莓植株的生长并提高其抗逆和抗病性。5、大田和温室试验结果显示KMXY1菌剂对蓝莓枯萎病防效为70 85%，增产
15 20%o
具体实施例方式实施例所用的设备均为市场销售的通用设备。实施例1 :生防菌剂的制备a.将菌株KMXUl移植到试管中进行一环活化，28°C培养48小时；试管中的PSA液体培养基为称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g普通蔗糖糖和17g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，15磅蒸气(121°C )灭菌20分钟；
b.取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5§/1，？117.0的1^培养液中，在120转/1^11、28 °C下培养72小时，获得发酵菌液；c.将发酵菌液按接种量1:200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度29°C或30°C或31°C，发酵16或17小时或18小时后，获得发酵用菌种；d.将发酵用菌种按接种量1:20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为29°C或30°C或31°C，发酵72或86小时或96小时，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85%或90%，酸碱度为6. 5或7. 5时，储存作为生防菌液；e.将生防菌液5000rpm离心6 min,取离心后的菌体与保藏液按1:50 (g/ml)配 成活性菌剂，成品中活菌总浓度为2 X 101° 2 X IO11 CFU/ml ;菌体保藏液为0. 015mol/L的磷酸盐缓冲液(常用的用于生物学研究的一种缓冲溶液，组成成分磷酸二氢钾34g，lmol/L氢氧化钠溶液175ml,蒸懼水825ml, PH7. 2)。实施例2 :平板拮抗试验按照方中达《植病研究方法》中的平板对持培养试验方法,对KMXYl菌对蓝莓枯萎病菌的抑制效果进行评价，同时灭菌蒸馏水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计结果如下，KMXYl对蓝莓枯萎病菌生长抑制率为90. 00% (表I所示)。说明KMXYl菌株对蓝莓枯萎病具有显著的抑制作用。表I KMXYl对蓝莓枯萎病菌及相关病菌的抑制作用
病原菌菌落直径
病原菌处埋生长抑制率(％)
(mm)
KMXYl990.00
蓝莓枯萎病菌---
灭菌蒸馏水900
KMXYl11. 587.22
三七根腐病菌---
灭菌蒸馏水900
KMXYl1286.67
烟草镰刀型枯萎病菌 ---
灭菌蒸馏水900实施例3 :蓝莓枯萎病温室防效试验设三个处理，处理I为灭菌水对照组，处理2为KMXYl菌剂稀释液，处理3为杀真菌剂多菌灵(南通润鸿生物化学有限公司)。蓝莓一年生组培苗移栽入蓝莓枯萎病菌病土中，移栽时用KMXYl菌剂1: 50倍液蘸根，边蘸根边移栽；作物移栽7 10天后用KMXYl菌剂1: 50倍菌液灌根，每公斤液体灌根5-6株作物；作物移栽100天后用KMXYl菌剂1: 50倍菌液灌根，每公斤液体灌根5-6株作物。其他清水对照和多菌灵农药处理同上述方法和用量。每667 Hf施用该制剂的量，根据作物移栽株数计算而定。结果显示，KMXYl菌剂在温室试验中对蓝莓枯萎病的防效达94. 47%，高于农药对照组。同时该菌剂能促进蓝莓植株的生长，生物量增长率为32. 11% (表2所示)。2010年I月15日移栽一年生蓝莓苗植株，在2010年12月进行调查，考察蓝莓的生长和病害发生的状况。表2 KMXYl对蓝莓枯萎病菌的温室试验结果
权利要求
1.一种防治蓝莓枯萎病的生防菌株KMXU1，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens), 2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO. 6598。
2.用权利要求1所述的生防菌株KMXUl制备的防治蓝莓枯萎病生防菌剂，其特征在于该生防菌剂经如下步骤得到a.将菌株KMXUl移植到试管中进行一环活化，280C培养48小时；试管中的PSA培养基为称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g普通蔗糖糖和17g琼脂，溶解后趁热纱布过滤，15磅温度为121°C的蒸气灭菌20分钟；b.取一环活化后的菌苔移入用IOOOml锥形瓶装的600ml配方为胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH7. O的LB培养液中，在120转/min、28 °C下培养72 小时，获得发酵菌液；c.将发酵菌液按接种量1:200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度29-31°C，发酵16-18小时后，获得发酵用菌种；d.将发酵用菌种按接种量1:20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，发酵罐的温度为29-31°C，发酵72-96小时，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85-90%，酸碱度为6. 5 7. 5时，储存作为生防菌液；e.将生防菌液5000rpm离心6min,取离心后的菌体与保藏液按1:50 g/ml配成活性菌剂，成品中活菌总浓度为2X IOltl 2X IO11 CFU/ml ;菌体保藏液为0. 015mol/L磷酸盐缓冲液。
全文摘要
防治蓝莓枯萎病的生防菌株KMXY1及其生防菌剂，属生物农药技术领域。菌株KMXU1的保藏号为CGMCC NO. 6597。菌剂经如下步骤得到菌株KMXU1移植到试管中进行一环活化，28℃ 培养48小时；活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml LB培养液中，在120转/min、28 ℃下培养72小时，获得发酵菌液；发酵菌液按接种量1200培的比例接种于种子罐中的LB培养液中发酵培养，种子罐的温度29-31℃，发酵16-18小时后，获得发酵用菌种；发酵用菌种按接种量120倍的比例接种于发酵罐中发酵培养，发酵罐的温度为29-31℃，发酵72-96小时储存作为生防菌液；生防菌液5000rpm离心6 min，与保藏液按150 (g/ml) 配成活性菌剂。本发明成本低，无毒害及污染，生防效果佳。并能有效防止蓝莓土传病害的连作障碍，提高蓝莓果实产量。
文档编号A01P3/00GK103013854SQ20121041018
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者余磊, 赵建荣 申请人:昆明学院