专利名称：一种贯众的繁殖方法
技术领域：
本发明涉及的是植物的繁殖方法，特别是一种贯众的繁殖方法。
背景技术：
贯众(Cyrtomium fortunei)为鱗毛厳科(Dryopteridaceae)多年生常绿草本，以根状茎及叶柄残基入药，具有清热解毒、止血、杀虫的作用，常用于治疗流行性感冒、乙型肝炎、病毒性肺炎、功能性子宫出血及虫积腹痛等症；还用于治疗高血压、头晕、头痛、慢性铅中毒等症(刘汉珍，俞浩，许文，何胜利.贯众的繁殖方法及栽培技术.中国野生植物资源， 2005，24 (3) :60-63)。同时，贯众又是一种优美的观赏植物和良好的水土保持植物(石雷.观赏蕨类.北京中国林业出版社，2002，151-152 ;刘汉珍，俞浩，许文，何胜利.贯众的繁殖方法及栽培技术.中国野生植物资源，2005，24 (3):60-63)。中药贯众的来源极其复杂，各地均使用当地或临近地区所生产的多种蕨类植物的根莖。目前市售的贯众药材除c. fortunei外，还有粗莖鳞毛蕨(DryopterisCrassirhixoma)、蛾眉厳(Lunathyrium acrostichoides)、单芽狗脊(Wood wardiaunigemmata)、紫萁(Osmunda Japonica)等30余种之多，分属于6个科。通过本草考证，中药贯众的药用来源应是C. fortunei (夏志俊.中药贯众本草原植物考证.中药材，1988，5 :23-25 ;张丽军，田少库，吴建华.贯众的研究进展.陕西中医，2002，23(8) :748-749)。通过10味中草药(贯众、黄连、板蓝根、黄芪、苦参、连翘、白术、葛根等)对沙门氏菌的体外抑菌实验发现，贯众、黄连对沙门氏菌的抑菌作用最强(李国旺，苗志国，赵恒章.板蓝根等10种中草药对沙门氏菌的体外抑菌试验.贵州农业科学，2010，38 (2) :142-144)。贯众中含有的间苯三酚类化合物，很少随植物的年龄、采集季节而变化，具有强力的驱虫作用，根状茎的粉末和粗提取物自古以来作为驱虫药物被沿用。其明显的活性和分类学价值是19世纪以来人们对其进行大量化学研究的原因(周荣汉，段金廒.植物化学分类学.上海上海科学技术出版社，2005，337-338)。由于贯众的人工繁殖栽培技术相对滞后，导致目前市售的贯众药材主要来源于东北、华北和长江中下游地区的野生贯众资源。且由于市场需求量较大，使得这些地区的贯众资源被过度开采，野生贯众资源遭到严重破坏。贯众的人工繁殖方法有分株繁殖和孢子繁殖。其中，分株繁殖的生长周期长且效率低，不利于药用贯众的规模化生产。贯众孢子繁殖技术一般是将贯众孢子播种于混合土壤培养基上进行培养(刘汉珍，俞浩，许文，何胜利.贯众的繁殖方法及栽培技术.中国野生植物资源，2005，24 (3) :60-63 ;吴芹.几种观赏蕨类植物的繁殖技术研究[D].南京南京林业大学，2007)，该方法培养出的贯众幼孢子体大约自播种后第110 - 190天出现，较本发明得到幼孢子体的时间晚45 — 125天，贯众的繁殖速度相当慢。徐艳使用贯众孢子无菌培养的方法，先用5% NaOCl溶液(每100 ml该溶液中含0.1ml吐温_80)将孢子灭菌4min，然后按4300个孢子/cm2的接种量，将贯众孢子接种于1/2MS固体培养基上进行培养，在孢子接种后80 90天可以看到幼孢子体产生(徐艳.观赏蕨类植物种质超低温保存研究[D].北京北京林业大学，2006)。
发明内容
本发明提出的是一种贯众的繁殖方法，其目的旨在弥补现有贯众繁殖技术存有的培育周期长、成本高和效率低等不足。将贯众的孢子经消毒后，接种于MS固体培养基上进行培养，获得孢子体苗，再经移栽得到贯众。本发明的技术解决方案一种贯众的繁殖方法，包括如下工艺步骤
一、培养基配制；
二、贯众孢子的灭菌； 三、接种及培养；
四、贯众幼孢子体苗的移栽及管理。本发明的优点本发明弥补了现有贯众繁殖技术培育周期长、成本高和效率低等的不足，开辟了一条人工繁殖贯众的新途径。用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子体，65天即可成苗，成苗率可达97%左右，使贯众的规模化工业生产成为可能，从而满足市场对贯众的需求，同时可减少对其野生资源和环境的破坏。此外，本发明还为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了良好的试验体系，具有广泛的应用前景。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I
贯众的繁殖方法，包括如下工艺步骤
工艺步骤一、培养基配制，
1)MS固体培养基用0. 7% (W/V)琼脂，pH 5. 8 ；
2)煮沸后分装至IOOml三角瓶中，然后121°C，高压(O. IMpa)蒸汽灭菌20 min。工艺步骤二、贯众孢子的灭菌，
1)用滤纸包裹住贯众的成熟孢子，用线捆住纸包，投入4%NaOCl水溶液，不时摇动，灭菌 4 min ；
2)用无菌水冲洗4遍；
3)打开纸包，用滴管吸取无菌水，并将贯众孢子冲洗至10ml离心管内，用旋涡混合器混合使成悬浊液，获得无菌贯众孢子悬浊液。工艺步骤三、接种及培养，
1)在无菌条件下，先用无菌水将上述配制的MS培养基的表面湿润，使MS培养基表面形成一层薄薄的水膜，视倾斜三角瓶时汇集在底部的水不能让滴管吸上连续的水滴为宜；
2)用滴管将步骤二获得的无菌贯众孢子悬浊液均匀接种在培养基上，接种密度为2000个孢子/cm2 ；
3)接种后，在23°C下，先暗培养24h，
4)转至光照下继续培养，光照强度为20001χ，光源为荧光灯，光照时间为每天10h，培
养7天。工艺步骤四、贯众孢子体苗分苗、移栽，1)培养7天后，孢子开始萌发，经30天形成配子体，65天形成孢子体苗，将高度2cm，叶片为2片以上无菌孢子体苗置于自然光照下炼苗6天；再置于空气中在相同的光照条件下炼苗6天；
2)打开瓶盖炼苗7天，然后用镊子轻轻夹出单株试管苗；
3)洗净培养基后，将单株试管苗移栽至装有混合土的穴盘中，放在阴凉避光处缓苗4天，然后移至温室培养，培养温度为23°C，光照强度为20001x，光照时间为IOh/天；所述的混合土包括的各组份的体积百分比为，草炭土 蛭石珍珠岩=211；
4)幼苗长至9cm，将其移栽到装有培养基质的塑料盆中，置温室培养，夏秋遮荫，春冬季保持白天温度21°C，夜间温度10°C，空气湿度70 %，缓苗25天，每半月浇MS营养液；所述 的营养液除不含琼脂外，其他成分与MS (Murashige and Skoog)固体培养基相同。所述的培养基质包括的各组份的体积百分比为草炭土 蛭石珍珠岩有机肥=4 2 2 I ο实施例2
贯众的繁殖方法，包括如下工艺步骤
工艺步骤一、培养基配制，
1)MS固体培养基用0. 7% (W/V)琼脂，pH 5. 8 ；
2)煮沸后分装至IOOml三角瓶中，然后121°C，高压(O. IMpa)蒸汽灭菌20 min。工艺步骤二、贯众孢子的灭菌，
1)用滤纸包裹住贯众的成熟孢子，用线捆住纸包，投入6%NaOCl水溶液，不时摇动，灭菌 4 min ；
2)用无菌水冲洗5遍；
3)打开纸包，用滴管吸取无菌水，并将贯众孢子冲洗至10ml离心管内，用旋涡混合器混合使成悬浊液，获得无菌贯众孢子悬浊液。工艺步骤三、接种及培养，
1)在无菌条件下，先用无菌水将上述配制的MS培养基的表面湿润，使MS培养基表面形成一层薄薄的水膜，视倾斜三角瓶时汇集在底部的水不能让滴管吸上连续的水滴为宜；
2)用滴管将步骤二获得的无菌贯众孢子悬浊液均匀接种在培养基上，接种密度为2500个孢子/cm2 ；
3)接种后，在27°C下，先暗培养36h，
4)转至光照下继续培养，光照强度为2300lx，光源为荧光灯，光照时间为每天14h，培养7天。工艺步骤四、贯众孢子体苗分苗、移栽，
1)培养7天后，孢子开始萌发，经32天形成配子体，65天形成孢子体苗，将高度4Cm,叶片为2片以上无菌孢子体苗置于自然光照下炼苗8天；再置于空气中在相同的光照条件下炼苗8天；
2)打开瓶盖炼苗7天，然后用镊子轻轻夹出单株试管苗；
3)洗净培养基后，将单株试管苗移栽至装有混合土的穴盘中，放在阴凉避光处缓苗5天，然后移至温室培养，培养温度为27°C，光照强度为23001x，光照时间为14h/天；所述的混合土包括的各组份的体积百分比为，草炭土 蛭石珍珠岩=211；4)幼苗长至11 cm，将其移栽到装有培养基质的塑料盆中，置温室培养，夏秋遮荫，春冬季保持白天温度26°C，夜间温度116°C，空气湿度90%，缓苗35天，每半月浇MS营养液；所述的营养液除不含琼脂外，其他成分与MS (Murashige and Skoog)固体培养基相同。所述的培养基质包括的各组份的体积百分比为草炭土 蛭石珍珠岩有机肥= 4 2 2 I o
权利要求
1.一种贯众的繁殖方法，其特征是该方法包括如下工艺步骤 一、培养基配制； 二、贯众孢子的灭菌； 三、接种及培养； 四、贯众孢子体苗的分苗、移栽。
2.根据权利要求I所述的一种贯众的繁殖方法，其特征是所述的工艺步骤一、培养基配制，分 1)MS (Murashige and Skoog)固体培养基0. 7% (W/V)琼脂，pH 5. 8 ； 2)煮沸后分装至IOOml三角瓶中，然后121°C，高压(O. IMpa)蒸汽灭菌20 min。
3.根据权利要求I所述的一种贯众的繁殖方法，其特征是所述的工艺步骤二、贯众孢子的灭菌，分 1)用滤纸包裹住贯众的成熟孢子，用线捆住纸包，投入4-6%NaOCl水溶液，不时摇动，灭菌4 min ； 2)用无菌水冲洗4-5遍； 3)打开纸包，用滴管吸取无菌水，并将贯众孢子冲洗至10ml离心管内，用旋涡混合器混合使成悬浊液，获得无菌贯众孢子悬浊液。
4.根据权利要求I所述的一种贯众的繁殖方法，其特征是所述的工艺步骤三、接种及培养，分 1)在无菌条件下，先用无菌水将上述配制的MS培养基的表面湿润，使MS培养基表面形成一层薄薄的水膜，以倾斜三角瓶时，视汇集在底部的水不能让滴管吸上连续的水滴为且； 2)用滴管将工艺步骤二获得的无菌贯众孢子悬浊液，均匀接种在培养基表面上，接种密度为2000- 2500个孢子/cm2 ； 3)接种后，在温度23-27°C，无光照下培养24-36h ； 4)转至光照下继续培养，其光照强度为2000-2300lx，光源为荧光灯，光照时间为每天10-14h，培养7天。
5.根据权利要求I所述的一种贯众的繁殖方法，其特征是所述的工艺步骤四、贯众孢子体苗分苗、移栽，分 I)培养7天后，孢子开始萌发，经30-32天形成配子体，65天形成孢子体苗，当叶片高度2-4 cm，将叶片为2片以上无菌孢子体苗置于自然光照下炼苗6-8天；再置于空气中在自然光照下炼苗6-8天； 2)打开瓶盖炼苗7天，然后用镊子轻轻夹出单株试管苗； 3)洗净培养基后，将单株试管苗移栽至装有混合土的穴盘中，并放在阴凉避光处缓苗4-5天，然后移至温室培养，温室培养的温度为23-27°C，光照强度为2000-2300 lx，光照时间为10-14h/天；所述的混合土包括的各组份的体积百分比为，草炭土 蛭石珍珠岩=2 I 1 ; 4)幼苗长至9-11cm,将其移栽到装有培养基质的塑料盆中，置温室培养，夏秋遮荫，春冬季保持白天温度21-26 °C，夜间温度10-16 °C，空气湿度70-90%，缓苗25-35天，每半月浇MSCMurashige and Skoog)营养液；所述的营养液除不含琼脂外,其他成分与MS(Murashigeand Skoog)固体培养基相同。
6.根据权利要求4所述的一种贯众的繁殖方法，其特征是所述的培养基质，其包括的各组份的体积百分比为草炭土 蛭石珍珠岩有机肥=4 2 2 :1。
全文摘要
本发明公开了一种贯众的繁殖方法，该方法包括如下工艺步骤一、培养基配制；二、贯众孢子的灭菌；三、接种及培养；四、贯众孢子体苗的分苗、移栽。优点本发明弥补了现有贯众繁殖技术培育周期长、成本高和效率低等的不足，开辟了一条人工繁殖贯众的新途径。用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子体，65天即可成苗，成苗率可达97％左右，使贯众的规模化工业生产成为可能，从而满足市场对贯众的需求，同时可减少对其野生资源和环境的破坏。此外，本发明还为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了良好的试验体系，具有广泛的应用前景。
文档编号A01H4/00GK102860262SQ20121041013
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者张开梅, 方炎明, 沈羽, 万劲 申请人:南京林业大学