专利名称：一种防治三七枯萎病的微生物有机磷肥的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治三七枯萎病的微生物有机磷肥，属微生物有机磷肥技术领域。
背景技术：
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)是五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材[I]，也是云南省最具特色的生物资源之一。三七具有散瘀止血、消肿定痛、调节血糖平衡、抗疲劳、抗衰老、耐缺氧和提高机体免疫力等多方面的药理作用和保健功能[2-3]。三七是多年生宿根草本植物，由于三七生长周期较长，生长条件苛刻(要求冬暖夏凉、无严寒与酷暑，半光半阴、潮湿的特定环境)，种植区域受限，仅分布在云南文山市各县以及广西与文山交界的几个地方[4]，因此与同属植物人参、西洋参一样，存在严重 的连作障碍问题[5]，即栽过一茬三七的土地要间隔至少八年甚至几十年才能再栽三七，如果缩短轮作年限则表现为三七地上部分生长不良，病害多，产量低，甚至毁园绝收[6]。三七枯萎病(Root rot disease)是三七生产中的毁灭性病害，其造成的损失占三七全部病害损失的70-85%，已成为制约三七产业可持续发展的严重障碍。三七枯萎病为多种病原菌协同侵染引起的土传复合病害(Complex disease),其病原包括真菌(Alternariapanax, A. tenuis, Cylindrocarpon destructans, C. didynum, Fusarium solani, F.oxysporum, Phytophthora cactorum, Phoma herbarum, Rhizoctonia solani) [7]。据调查统计三七轮作间隔4 5年，发病率达30%以上；间隔8年以上，发病率在10% 15%。因此，连作障碍导致三七适宜种植地块十分紧张，已呈现出由适宜种植区域向次适宜区域转移，不仅增加了“七农”的种植成本，还严重影响了三七的产量和质量。连作障碍也成为制约三七产业发展的重大问题。利用开垦新地和与非寄主作物轮作或休闲8 10年以上是传统解决这一问题有效的方法。但是近年来，随着三七规模化种植面积的不断扩大，此方法已不能满足市场需要，而施用化学农药直接影响三七质量和污染环境。因此，一种安全、有效的防治措施，在此背景下，生物防治被赋予极大的期望。三七作为一种区域性植物，其根腐复合病害的生物防治极少被广泛关注，但部分研究已经表明生防微生物在三七枯萎病防治方面有较好的应用前景。用微生物菌剂拌种(苗)处理，在三七生长前期，对枯萎病有明显的控制效果(陈昱君等，2004);从三七根际土壤中分离的三株芽孢杆菌对三七枯萎病病原菌中的坏损柱孢霉(C. destructans)具有较好的抑菌作用，具备研发生物农药的潜力(刘立志等，2004)。生防微生物在植物根际良好的定殖、生存及繁殖能力是其发挥生防效果的前提；良好的根际定殖能力已经成为筛选土传病害拮抗微生物的重要考察参数。生物有机磷肥是采用经过高能活化的磷矿物为主要原料，在特效菌种的作用下与有机质共同发酵处理而得到的；其特点是长效缓释、非酸化、非水溶性，后效性显著，一季使用多季有效；该肥料的使用能优化土壤矿物组成和结构，避免化学肥料对农产品质量及土壤酸化的不良影响，达到增产、改善品质、绿色生态的效果。本发明利用一种能高效消除三七枯萎病连作障碍的高效拮抗菌(解淀粉芽孢杆菌)与生物有机磷肥相结合，生产出一种既能对种植三七的土壤土传病害进行生物消毒又能为种植地提供持久养分的药肥双效生物有机肥料。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。参考文献[I]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版).北京化学工业出版社，2010: 10-11.[2] Sun S，Wang CZ, Tong R, Li XL, Fishbein A, Wang Q, He TC, Du ff, YuanCS. Effects of steaming the root of Panax notoginseng on chemical compositionand anticancer activities. Food Chemistry, 2010, 118(2): 307-314. [3]甘雨，徐惠波，孙晓波.三七总皂苷的药理作用研究进展.时珍国医国药，2007，18 (5): 1251-1252. [4] Guo HB, Cui XM, An N and Cai GP. Sanchi ginseng (Panax notoginseng(Burkill) F. H. Chen) in China:distribution, cultivation and variations.Genetic Resources and Crop Evolution, 2010, 57: 453—460.[5]简在友，王文全，孟丽，张子龙.人参属药用植物连作障碍研究进展.中国现代中药，2008，10 (6) :3-5.[6]张重义，林文雄.药用植物的化感自毒作用与连作障碍.中国生态农业学报，2009，17 (I) :189-196.[7]缪作清，李世东，刘杏忠，等.三七根腐病病原研究.中国农业科学.2006， 39: 1371-1378.[8]陈昱君，王勇，刘芸芝，等.生物菌剂控制三七根腐病的初步研究.中国中药杂志.2004，29 (11) :1102-1103.[9]刘立志，王启方，张克勤，等.三七根腐病拮抗菌的筛选及活性产物的初步分析 云南大学学报.2004，6(4) :357-359.
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种使用方便，成本低，效果明显，无毒、无害的防治三七枯萎病的微生物有机磷肥。本发明的目的是这样实现的本发明从云南省曲靖市富源县蓝莓种植区蓝莓根际土壤中分离得到菌株KMXY1，对其鉴定结果表明该细菌属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期2012年9月21 ;保藏号=CGMCC NO. 6598。此解淀粉芽孢杆菌菌体特征及菌落特征菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。该拮抗菌与有机磷肥堆肥混合制成微生物有机肥料，肥料中含有I X IO10个/g以上的拮抗微生物数量，总氮磷钾养分为6 8 %，有机质含量为40 %。本发明的防治三七枯萎病的微生物有机磷肥经过如下具体步骤得到
(I)、生防菌种子液的制备a.将保藏号为CGMCC NO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，29°C培养48小时，LB培养基配方为胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 5g/L, pH7. 0,琼脂 17g/L ；b.取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 5g/L,pH7.0 组成的LB培养液中，在110转/min、29 °C下培养72小时，获得发酵菌液；c.将培发酵菌液按接种量1:200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，29-31°C发酵16-18小时,获得发酵用菌种；d.将发酵用菌种按接种量1:20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培 养液中发酵培养，29-31°C发酵72-96小时后，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85-90%时，即获得菌含量为IX IO11个/g以上的菌液时，出罐储存作为生防菌种子液；(2)、生物有机磷肥基质的制备a.分别将水葫芦渣干燥并粉碎，粉碎细度< 5cm ;草炭烘干或风干后粉碎，粉碎至(0. 45mm ;腐植酸粉碎至彡0. 45mm ;含量20_24%、磷矿粉粉碎至彡400目；b.将a.步骤粉碎后水葫芦渣、草炭、腐植酸、磷矿粉质按质量比5 3 1 1的比例混合均匀，堆捂后自然发酵20-25天，其间当温度升至62°C时进行翻堆以充分发酵，翻堆后继续发酵，直至物料均为灰黑褐色时，物料发酵成熟，即得生物有机磷肥基质；(3)、防治三七枯萎病的微生物有机磷肥的制备将(I)步骤的生防菌种子液菌含量为IXlO11个/g以上时与步骤(2)的生物有机磷肥基质混合均匀，使混合肥料中含有I XlOltl个/g以上的拮抗微生物数量、全氮含量为5 6%，总氮磷钾养分为6 8%、有机质含量为40%，包装即为成品。本发明所用的设备均为市场销售的通用设备。本发明的优点在于1、成本低，使用方便，效果明显，无毒、无害、无环境造成污染。2、该肥料不仅能对种植三七土壤中的有害病菌进行充分消毒，而且能够补充三七生长所需的营养元素，改良连作障碍土壤的理化性状和土壤微生物活性，提高三七植株的抗逆性。
具体实施例方式实施例所用的设备均为市场销售的通用设备。实施例1 :1、制备防治三七枯萎病的微生物有机磷肥(I)、生防菌种子液的制备a.将保藏号为CGMCC NO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，29°C培养48小时，LB培养基配方为胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 5g/L, pH7. 0,琼脂 17g/L ；b.取一环活化后的菌苔移入用1000ml锥形瓶装的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 5g/L,pH7.0 组成的LB培养液中，在110转/min、29 °C下培养72小时，获得发酵菌液；c.将培发酵菌液按接种量1:200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，29°C或30°C或31°C发酵16小时或17小时或18小时，获得发酵用菌种；d.将发酵用菌种按接种量1:20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，或30°C或31°C发酵72小时或86小时或96小时后，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85或90%时，出罐储存作为生防菌种子液；(2)、生物有机磷肥基质的制备a.分别将水葫芦渣干燥并粉碎，粉碎细度< 5cm ;草炭烘干或风干后粉碎，粉碎至(0. 45mm ;腐植酸粉碎至彡0. 45mm ;含量20%或24%的磷矿粉粉碎至彡400目；b.将a.步骤粉碎后水葫芦渣、草炭、腐植酸、磷矿粉质按质量比5 3 1 1的比例混合均匀，堆捂后自然发酵20-25天，其间当温度升至62°C时进行翻堆以充分发酵，翻堆后继续发酵，直至物料均为灰黑褐色时，物料发酵成熟，即得生物有机磷肥基质；(3)、防治三七枯萎病的微生物有机磷肥的制备将(I)步骤的生防菌种子液菌含量为IXlO11个/g以上时与步骤(2)的生物有机磷肥基质混合均匀，使混合肥料中含有I XlOltl个/g以上的拮抗微生物数量、全氮含量为5%或6%,总氮磷钾养分为6%或7%或8%、有机质含量为40%,包装即为成品。2、防治三七枯萎病的微生物有机磷肥的应用2009-2011年在云南省文山州进行相关试验，供试农田土壤理化性状基本相同，肥力中等。采用随机设计，设连作土壤、本肥料施用连作土壤和新地(尚未种植过三七)3个处理，每处理各重复3次，各小区面积均为200m2。2009年11月，对即将施用本肥料实施例做底肥一次性施入土壤，用量为16000kg/hm2，然后均匀翻耕；连作和新作地处理按照当地常规方法施用复合肥400kg/hm2，2010年I月15日移栽一年生三七苗植株，栽植密度为35万棵/hm2，其余田间管理措施同当地常规。在2010年12月进行田间调查，考察三七的生长和病害发生等状况，收获测产。实验结果如下表。防枯萎病微生物有机磷肥对三七枯萎病菌的田间试验结果
权利要求
1. 一种防治三七枯萎病的微生物有机磷肥，其特征在于该微生物有机磷肥经如下步骤制(1)、生防菌种子液的制备a.将保藏号为CGMCCNO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培养基的试管进行一环活化，29°C培养48小时，LB培养基配方为胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 5g/L, ρΗ7· O,琼脂 17g/L ；b.取一环活化后的菌苔移入用IOOOml锥形瓶装的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 5g/L，ρΗ7· O 组成的 LB培养液中，在110转/min、29 °C下培养72小时，获得发酵菌液；c.将培发酵菌液按接种量1:200培的比例接种于种子罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，29-31°C发酵16-18小时,获得发酵用菌种；d.将发酵用菌种按接种量1:20倍的比例接种于发酵罐中与b步骤相同的LB培养液中发酵培养，29-31°C发酵72-96小时后，当发酵罐中的发酵液中芽孢含量大于或等于85-90% 时，即获得菌含量为I X IO11个/g以上的菌液时，出罐储存作为生防菌种子液；(2)、生物有机磷肥基质的制备a.分别将水葫芦渣干燥并粉碎，粉碎细度<5cm;草炭烘干或风干后粉碎，粉碎至 (O. 45mm ;腐植酸粉碎至彡O. 45mm ;含量20_24%、磷矿粉粉碎至彡400目；b.将a.步骤粉碎后水葫芦渣、草炭、腐植酸、磷矿粉质按质量比53 1 1的比例混合均匀，堆捂后自然发酵20-25天，其间当温度升至62°C时进行翻堆以充分发酵，翻堆后继续发酵，直至物料均为灰黑褐色时，物料发酵成熟，即得生物有机磷肥基质；(3)、防治三七枯萎病的微生物有机磷肥的制备将(I)步骤的生防菌种子液菌含量为IXlO11个/g以上时与步骤(2)的生物有机磷肥基质混合均匀，使混合肥料中含有I XlOltl个/g以上的拮抗微生物数量、全氮含量为5 6%，总氮磷钾养分为6 8%、有机质含量为40%，包装即为成品。
全文摘要
防治三七枯萎病的微生物有机磷肥，属微生物有机磷肥技术领域。本发明用解淀粉芽孢杆菌，通过液体发酵培养制备生防菌种子液；将粉碎的水葫芦渣草炭腐植酸含量20-24%、细度400-450目的磷矿粉以 5311比例混合发酵得生物磷肥基质；再将生防菌种子液与生物磷肥基质混匀，制成防治三七枯萎病的微生物有机磷肥，肥料中含有1×1010个/g以上的拮抗微生物数量、全氮含量为5～6％，总氮磷钾养分为6～8％、有机质含量为40％。本发明的优点在于成本低，使用方便，效果明显，无毒、无害、无环境造成污染；能对种植三七土壤中的有害病菌进行充分消毒，并补充三七生长所需的营养元素，改良连作障碍土壤的理化性状和微生物活性，提高三七植株的抗逆性。
文档编号C05F11/08GK103011918SQ201210410170
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者余磊, 赵建荣 申请人:昆明学院