专利名称：一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法
技术领域：
本发明属水产养殖技术领域，涉及黄颡鱼的人工繁殖关键技术，尤其是涉及一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法。
背景技术：
养殖鱼类的种苗生产一般是通过自然繁殖和人工繁殖两种途径获得，而大规模生产主要依靠人工繁殖实现；在人工繁殖生产过程中，受精率是生产的关键技术指标，而影响受精率的关键因子，除卵子和精子的质量外，人工授精方法也是影响受精率的稳定性一个重要因素；目前常规的人工授精方法，无论是湿法授精，或是干法授精，卵子和精子的受精 过程是以水媒介同步激活后完成，对于强粘性卵类型的鱼类如黄颡鱼，人工授精过程中卵遇水后极易粘成团或成块，不仅影响人工授精的操作，而且还影响受精率的稳定性，降低孵化率；
目前黄颡鱼种苗繁育也是通过池塘自然产卵或人工繁殖方式获得，尽管自然产卵的生产方式成本较低，但由于自然产卵受气候、水温等因素的影响，产卵的不同步和不稳定，其生产规模都难以满足大规模生产的要求；而黄颡鱼人工繁殖过程，雌、雄鱼发情不同步，常规的人工授精方法因需同步采卵和采精，采卵过程易挤伤内脏造成雌鱼产后死亡率高，雄鱼需杀雄取精，通过研磨或剪碎精巢取得精子，易受带入的血块等组织的污染，精子保存时间短，雄鱼浪费大，而且受精过程时间控制严格，遇水后卵易成团，影响人工授精的操作及孵化率；因此，常规的黄颡鱼人工授精方法，授精条件的可控性较差，生产操作难度较高，影响规模化生产的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种克服上述现有技术缺点的，解决黄颡鱼在人工繁殖过程中受精率不稳定状况的，减少人工授精过程的干扰因子的，同时具有操作更简捷、更稳定、生产效率更高的一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法；
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为该种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，包括以下步骤
(1)经注射激素催情发情的雄鱼，在下颌靠近心脏处剪断动脉处放血l-3min后取出精巢，用精子保存液冲洗1-3次，将精巢放入80-120目的筛絹中挤出精液，每尾雄鱼收集的精液用10-50ml精子保存液稀释4-8°C保存待用；
(2)经注射激素催情发情的雌鱼，采用两指挤卵方式采集卵子，即一只手抓住黄颡鱼头部，另一只手虎口轻扣背鳍硬刺后基部，大拇指和食指轻扣腹部，沿生殖孔方向轻轻滑动挤压，将卵挤入干燥碗中或盆中，每批鱼卵的采集时间控制20min之内；
(3)取300-500ml左右的低渗溶液，加入2_4ml经精子保存液稀释的精液，搅拌3 5s预激活精子，然后将混合液倒入到500-1000g的卵子中，搅拌20-30s左右，即完成人工授精过程；所述的一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，其特征在于所述黄颡鱼精子保存液配方为柠檬酸三钠7. 5g，葡萄糖29g，氯化钾O. 2g，碳酸氢钠2. Ig,磷酸二氢钾O. 06g,抗坏血酸O. lg, ATP O. 05g,防腐剂O. 3g和蒸懼水IOOOml,试剂要求等级为分析纯或生化级，配制的溶液4°C下保存；
所述的一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，其特征在于低渗溶液的浓度为
O.2% O. 4%的NaCl水溶液，或是NaCl和KCl的3:1比例的水溶液，在人工授精时提前2_3小时配制，常温保存。本发明与现有技术相比的有益效果本发明一种黄颡鱼在低渗透压溶液的人工授精方法，其精子采集通过放血和筛絹挤压方式采集精子，避免了精子采集过程中血污和其它组织的污染，提高了精子采集质量；精子预先采集在精子保存液中4°C冷藏保存，保存24h精子的激活率超过90%，对受精率无显著影响，保存72h精子激活率仍在50%以上，解决 了黄颡鱼精子保存和精卵同步采集的技术问题；挤卵方式通过一只手的虎口轻轻压住背鳍硬刺基部，大拇指和食指轻扣腹部，虎口、大拇指和食指沿生殖孔方向滑动的挤压方式，减少了挤卵过程对内脏的损伤，减少了挤空卵所需要的次数，提高挤卵效率，雌鱼产后成活率可保持在90%以上；
人工授精过程以低渗溶液取代水为受精媒介，卵子和精子都能在低渗透压溶液中激活，精子的激活率超过90%，精子的活力和寿命显著延长，精子的活力可从21s 23s提高到32s 35s，延长了受精时间；通过精子在低渗溶液中预激活人工授精比精卵同步人工授精的受精率提高10%左右，每尾雄鱼的精液能够配备7. 5kg卵子人工授精，显著降低雄鱼的消耗，受精的卵在低渗溶液中不存在粘性，遇水后可恢复粘性，减少了受精过程中的干扰因子，增强了人工授精的稳定性，显著提高了受精率，操作更灵活、简便和快捷，更适合规模化生产，也适用于同性质卵类型的鱼类。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明；应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围；
本实施例的黄颡鱼亲鱼，为2011年6月从江苏省射阳县的射阳河收集，在公司养殖基地驯养I年的2冬龄以上黄颡鱼，催产时雌鱼均重137. 6±4. 2g，成熟系数18. 7±3. 1%，雄鱼均重274. 8±3. 6g;在水温26°C 28°C条件下，从6月18日至6月23日连续催产6个批次，每批雌鱼150kg左右，雄鱼3尾；具体操作方法及结果如下
①人工催情雌鱼采用二针注射，第一针注射LHRH-A212ug/kg，第二针注射LHRH-A212ug/kg+D0M 3. 5mg/kg+HCG 1500IU/kg，两针的间隔时间为14 16h ;雄鱼采用一针注射，剂量为雌鱼的40%，在注射雌鱼的第二针时注射；采用背鳍基部注射，注射后放入20m2水泥池中，流水饲养，为防止缺氧，用气泵增氧；
②精子保存液的配制黄颡鱼精子保存液配方为柠檬酸三钠7.5g，葡萄糖29g，氯化钾O. 2g,碳酸氢钠2. Ig,磷酸二氢钾O. 06g,抗坏血酸O. lg, ATP O. 05g,防腐剂O. 3g和蒸懼水1000ml，试剂要求等级为分析纯或生化级；按所述的配方配制IOOOml精子保存液，转移至IOOOml的棕色广口瓶中在4°C冷藏待用；③精子采集与保存注射激素后约13h后雄鱼开始发情，在雄鱼下颌靠近心脏用剪刀剪断动脉，在水中放血2min左右；将雄鱼擦干从肛门口沿腹部剪开，用镊子取出精巢，用精子保存液冲洗2次，冲洗后的精巢放在100目筛絹中挤压出的精液至IOOml的棕色广口瓶中，再用IOml注射器吸取IOml精子保存液洗涤筛絹上剩余的精液一起转移至广口瓶中，稀释至90ml摇匀在4°C冷藏保存；
④卵子的采集和人工授精雌鱼注射约14h发情产卵，用毛巾擦干鱼体，将卵挤入到容量2000ml干燥的不锈钢碗中，每批卵控制500g在左右；取300ml浓度为O. 3%的低渗溶液，加入I. 5ml稀释后的精液搅拌3 5s，迅速倒入卵中搅拌40s，完成授精过程；
⑤脱粘与孵化将授精后的卵沉淀30s，倾去上清液，放入8%浓度的黄泥浆悬浊液中搅拌2min，倒入60目筛絹中滤去悬浊液，再用清水漂洗干净，然后将卵移至容量约80L的孵化桶中孵化，每个孵化桶放入6kg的受精卵，孵化过程按常规方法管理孵化； ⑥实施结果卵和鱼苗的数量按重量法计数，卵发育至原肠中期开始计算受精率；6批共催产雌鱼936kg，催产率92. 30± I. 68%，共获得卵5349. 4万粒，受精率86. I ±5. 2%，孵化出鱼苗3608. 8万尾，出苗率78. 4±3. 9%。
权利要求
1.一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，包括以下步骤 (1)经注射激素催情发情的雄鱼，在下颌靠近心脏处剪断动脉处放血l-3min后取出精巢，用精子保存液冲洗1-3次，将精巢放入80-120目的筛絹中挤出精液，每尾雄鱼收集的精液用10-50ml精子保存液稀释4-8°C保存待用； (2)经注射激素催情发情的雌鱼，采用两指挤卵方式采集卵子，即一只手抓住黄颡鱼头部，另一只手虎口轻扣背鳍硬刺后基部，大拇指和食指轻扣腹部，沿生殖孔方向轻轻滑动挤压，将卵挤入干燥碗中或盆中，每批鱼卵的采集时间控制20min之内； (3)取300-500ml左右的低渗溶液，加入2_4ml经精子保存液稀释的精液，搅拌3 5s预激活精子，然后将混合液倒入到500-1000g的卵子中，搅拌20-30s左右，即完成人工授精过程。
2.根据权利要求I所述的一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，其特征在于所 述黄颡鱼精子保存液配方为柠檬酸三钠7. 5g，葡萄糖29g，氯化钾O. 2g，碳酸氢钠2. Ig,磷酸二氢钾O. 06g，抗坏血酸O. lg, ATP O. 05g，防腐剂O. 3g和蒸馏水1000ml，试剂要求等级为分析纯或生化级，配制的溶液4°C下保存。
3.根据权利要求I所述的一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，其特征在于低渗溶液的浓度为O. 2% O. 4%的NaCl水溶液，或是NaCl和KCl的3:1比例的水溶液，在人工授精时提前2-3小时配制，常温保存。
全文摘要
一种黄颡鱼在低渗溶液中的人工授精方法，属水产养殖技术，通过创新黄颡鱼精卵的采集方式、精子保存液的设计以及在低渗溶液中采用预激活精子完成人工授精的技术。其技术方案包括以下要点(1)雄鱼经放血后取出的精巢在筛绢中以挤压方式滤出精液，提高精子采集质量，在保存液中冷藏保存，每尾雄鱼精液可供7.5kg的卵子人工授精；(2)两指挤卵方式降低了对雌鱼内脏损伤，提高产后成活率；(3)以0.2～0.4%浓度低渗溶液取代水为受精媒介，在低渗溶液中预激活精子后与卵子授精，提高了精子活力和人工授精条件的可控性，从而提高了人工授精的受精率和稳定性。此方法稳定可靠，适合大规模生产，也适用于同性质卵类型的鱼类。
文档编号A01K61/00GK102960279SQ20121050323
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者王德忠, 徐汉连 申请人:射阳康余水产技术有限公司