专利名称：一种评价转基因棉花对非靶标生物影响的检测方法
一种评价转基因棉花对非靶标生物影响的检测方法技术领域
本发明属于转基因作物生态风险评价领域，具体涉及一种利用双斑青步甲评价转 Bt基因棉花抗虫性的检测方法。
背景技术：
转基因棉花于1996年开始大规模商业化种植，至2010年全球种植面积达到2100 万hm2。转基因棉花能有效控制棉田害虫，降低种植成本，提高棉花产量。转Bt基因棉花靶标生物为鳞翅目昆虫，大量研究结果表明其在短期内对棉铃虫有很强的致死作用。然而，由于棉铃虫的适应性，转Bt基因棉花抗虫性的长期效果不得而知。目前，评价转Bt基因棉花抗虫性方法主要有叶片饲喂幼虫法、叶片接种虫卵法和酶联免疫法。前两种方法主要用鳞翅目幼虫死亡率反映转Bt基因棉花的抗虫性，幼虫死亡率高说明抗虫性高；酶联免疫法的原理则是利用抗虫蛋白表达量反映抗虫性。但这些方法都局限在小尺度范围内，而且成本较高，在实际应用中有很大的局限性。因此，探索合适的评价转Bt基因棉花抗虫性的方法十分必要。
地表甲虫是农田生态系统生物群落的重要组成部分，地表甲虫在维持农田生态系统生物多样性、防治农业害虫和维持物质循环和能量流动方面有重要作用。根据其食性差异，甲虫可划分为植食性甲虫、粪食性、肉食性甲虫和杂食性甲虫等几大类。其中，肉食性甲虫如步甲、瓢虫等可以捕食多种农业害虫，是农田生态系统中害虫的主要天敌。相对于其他天敌，地表甲虫移动范围窄，以鳞翅目昆虫为食的地表甲虫对棉铃虫数量变化反应尤为敏感。研究表明，转基因作物能够改变农田生态系统中的处于较高营养级水平的捕食性甲虫的种群动态。
双斑青步甲是棉田生态系统捕食性甲虫中的优势种，主要捕食鳞翅目昆虫。转Bt 基因棉花对鳞翅目昆虫有毒性，鳞翅目昆虫取食含有杀虫晶体蛋白的棉花会致死，数量减少，双斑青步甲因得不到足够食物而死亡或迁出棉田，数量降低。因此，可以根据双斑青步甲的种群数量预测转Bt基因棉花对鳞翅目昆虫的致死程度，从而评价转Bt基因棉花的抗虫性。 发明内容
本发明的目的在于介绍一种利用棉田生态系统中处于高营养级的捕食者的种群特征指示转Bt基因棉花抗虫性的检测方法。本发明方法是根据棉田生态系统食物链特征和双斑青步甲生物学特性，通过陷阱法和引诱剂法相结合调查地表昆虫，利用双斑青步甲种群数量变化快速有效地检测大田中转Bt基因棉花的抗虫性。
本发明的技术方案是利用双斑青步甲检测转Bt基因棉花的抗虫性。
上述棉花是指转Bt基因棉花及其对照亲本棉花。
上述甲虫是指用陷阱法和引诱剂法捕获的甲虫。
上述捕食性甲虫是指双斑青步甲。
本发明具有如下的有益效果本发明属于检测新方法，利用棉田生态系统主要捕食性甲虫-双斑青步甲作为指示物种，检测转Bt基因棉花抗虫效果，不需要大规模监测转Bt基因棉花的靶标生物相关指标， 极大地降低了劳动强度、节约了成本。
本发明操作方法简单、成本低、可靠性高，在评价转Bt基因棉花抗虫效果方面具有广阔的应用前景。
图1为转Bt基因及其亲本棉田生态系统中的双斑青步甲与棉铃虫之间的关系图；图2为转Bt基因及其亲本棉田生态系统中的棉铃虫密度分布图；图3为转Bt基因及其亲本棉田生态系统甲虫捕食者中的双斑青步甲所占比例。其中， A表示其他捕食者比例，B表示双斑青步甲比例；图4为室内试验双斑青步甲对棉铃虫的取食率。
具体实施方式
本发明的方法主要包括如下五个部分(1)确定转Bt基因棉田和对照棉田生态系统中的双斑青步甲-棉铃虫-棉花的三级食物链关系；(2)调查棉铃虫的数量；(3)调查双斑青步甲的数量(4)建立双斑青步甲和棉铃虫的数量关系(5)转Bt基因棉田中的双斑青步甲的数量低，说明转Bt基因棉花具有强的抗虫性实施例
2011年7月至9月，在南京环科所六合棉花基地，调查中棉30 (转Bt基因棉)和中棉16 (中棉30亲本，非转基因棉)棉田中的捕食者和棉铃虫种群数量,每个棉花品种调查三块样地，每块样地面积为2亩左右。甲虫调查采用陷阱法和引诱法相结合的方法，在每块样地按棋盘法布置30个诱杯，诱杯为内壁光滑的塑料杯(高12 cm, 口径9 cm,杯壁上方1/4处打4个直径为1. 5mm的排水孔)，每个诱杯加I份引诱剂，引诱剂为醋、糖、酒精、蜂蜜和水的混合物。先用微火将糖醋75%酒精质量比为5 :4 :1的混合物熬制成浓糖浆，熬制后每IOml浓糖浆混入5ml蜂蜜和20ml75%酒精作为I份引诱剂。每隔7天放一次引诱剂，诱杯放置时间为10天。记录所有捕食者的数量并统计双斑青步甲的数量。棉铃虫密度调查为抽样调查法即每块样地选取6株棉花，记录每株棉花上的棉铃虫数量。分别于7、8、 9月各调查一次。另外，在室内开展双斑青步甲对棉铃虫的捕食效率实验将2只双斑青步甲和15只棉铃虫成虫放置在透明玻璃箱内，重复3次，每天记录一次棉铃虫剩余数。
调查结果显示，双斑青步甲和棉铃虫的密度之间显著正相关(图1);转财基因棉田中棉铃虫数量显著低于亲本(图2);双斑青步甲在棉田甲虫中比例高于60% (图3)。室内实验表明，双斑青步甲能有效捕食棉铃虫，平均每天取食1. 4只(图4)。
以上实验结果表明，转Bt基因棉花能显著降低棉铃虫的数量，从而导致其主要捕食者-双 斑青步甲的数量也明显降低。因此，利用双斑青步甲检测转Bt基因棉花抗虫性的方法是可行的，准确的。
权利要求
1.一种评价转基因棉花对非靶标生物影响的检测方法，其特征是利用双斑青步甲作为指示物种评价转Bt基因棉花对鳞翅目昆虫的抗性，具体由以下步骤构成(1)确定棉田生态系统中的双斑青步甲-棉铃虫-棉花的三级食物链关系；(2)调查棉铃虫的数量；(3)调查双斑青步甲的数量；(4)建立双斑青步甲和棉铃虫的数量关系；(5)转Bt基因棉田中的双斑青步甲的数量低，说明转Bt基因棉花具有强的抗虫性。
2.权利要求1所述的评价转基因棉花对非靶标生物影响的检测方法在转基因作物抗虫性评价中的应用。
全文摘要
本发明属于转基因作物生态风险评价领域，具体涉及一种利用双斑青步甲评价转Bt基因棉花抗虫性的检测方法。该方法的原理是利用棉田生态系统中的食物链关系、即双斑青步甲-棉铃虫-棉花，以捕食者种群的数量反映转Bt基因棉花对靶标生物-鳞翅目昆虫(棉铃虫)的致死程度。在多年种植转Bt棉花棉田和对照棉花棉田内，利用陷阱法和引诱剂法相结合诱捕双斑青步甲，比较两种棉花棉田内的双斑青步甲数量。双斑青步甲在转Bt基因棉花棉田的数量低，说明转Bt基因棉花抗虫性高。该检测方法准确，成本低，便于应用。
文档编号A01G7/00GK102986462SQ20121050648
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者孙书存, 吴新卫, 曹瑞 申请人:南京大学