专利名称：一种评价转基因棉花对粪甲虫影响的检测方法
技术领域：
本发明属于转基因作物生态风险评价技术领域，具体涉及一种评价转Bt基因棉花对粪甲虫影响的检测方法。
背景技术：
目前，转基因技术已广泛应用于农业领域，显著地提高了农作物产量，但由于其不同于传统意义上的作物育种，人们很难预测基因进入一个新的遗传背景会产生什么样的后果。所以，各国科学家在注重转基因作物带来效益的同时，也一直关注其潜在的生态风险。
1987年，Vaeck首次报道将Bt杀虫蛋白基因转入棉花，开启了转基因棉花的大规模种植年代。截至目前，转基因抗虫棉种植面积占全球棉花种植面积的20%以上。其中，作为世界上抗虫棉种植面积最大的国家，我国转基因抗虫棉种植面积超过棉花种植总面积的70%。抗虫棉能有效提高棉花产量、减少杀虫剂用量、节约劳力等，具有巨大的社会效益和经济效益。然而，由于不同类型Bt杀虫蛋白有不同的杀虫谱，因而转基因棉花中不同Bt基因表达必然会对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等许多非靶标昆虫产生影响。因此，随着转基因棉花在全球范围内的大规模种植，对其生态安全性尤其是转Bt基因对非靶标昆虫影响的评价工作也大量开展。而对于转基因棉花可能对土壤动物产生的影响，主要集中于鳞翅目昆虫及其幼虫，关于抗虫棉对土壤动物中的鞘翅目昆虫影响的评价则很少开展，尤其是鞘翅目中非常重要的一类-粪甲虫的相关研究尚未见报道。粪甲虫是一类全变态昆虫，其生活周期有卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。粪甲虫成虫对新鲜动物粪便(尤其是牛粪)极为喜好，除在牛粪中取食外，还在其中交配、产卵并完成卵化等过程，因此其生活史主要是在动物粪便或其他碎屑系统中完成，是一类典型的大型土壤动物。粪甲虫在生态系统功能过程如促进养分循环，增加生物扰动，提高植物生产力，二次种子传播者，控制寄生虫，与有益寄生虫的协同进化，控制苍蝇及传粉等中具有非常重要的作用。粪甲虫成虫为咀嚼式口器，主要取食牛粪中微生物含量高的流质食物和易消化的植物残渣，固体食物颗粒直径一般小于O. 03mm，其幼虫对食物的选择性不强。环境条件适宜的情况下，粪甲虫在3-6天就开始产卵，卵化时间在产卵后5天左右开始，其幼虫阶段较长，也可能以幼虫的形式越冬。因此，通过将棉花粉碎(颗粒直径小于O. 03mm)与牛粪充分混合后饲养粪甲虫，能快速有效地检测抗虫棉对粪甲虫群落特征和结构的影响。
发明内容
本发明的目的在于填补目前评价转Bt基因棉花对粪甲虫影响的检测方法空白。本发明的方法，是根据粪甲虫的取食特点和生活史特征，利用新鲜牛粪与粉碎棉花叶的混合物饲养粪甲虫，能快速有效地检测转Bt基因棉花对非靶标生物的影响。本发明的技术方案是利用新鲜牛粪与粉碎棉花叶的混合物检测转Bt基因棉花对粪甲虫的影响。上述牛粪为新鲜牛粪。
上述粉碎棉花叶为新鲜棉花叶，粉碎后的颗粒直径小于O. 03mm。本发明具有如下的有益效果
本发明属于检测新方法，由于考虑到粪甲虫的取食特点，将新鲜棉花叶粉碎至颗粒直径小于O. 03_后，不会影响粪甲虫及其幼虫对棉花叶的取食。考虑到粪甲虫的生活史特征，利用粪甲虫对新鲜牛粪的依赖性，有效吸引甲虫，同时牛粪的成本低廉，极大地节约了成本。另外，本发明充分利用粪甲虫的产卵期和卵化期较短的特征，能够在短期内检测到转基因棉花对甲虫种群特征的影响，极大地缩短了检测周期。本发明操作方法简单，成本低，检测时间短，对于评价转Bt基因棉花对粪甲虫的影响具有广阔的应用前景。实验证明，使用本发明所提供的利用新鲜牛粪与粉碎棉花评价转Bt基因作物对粪甲虫群落影响的方法，达到了预期目的。
图I为转Bt基因抗虫棉及其亲本处理中的甲虫产卵率比较 图2为转Bt基因抗虫棉及其亲本处理中的甲虫卵化率比较 图3为转Bt基因抗虫棉及其亲本处理中的甲虫成虫死亡率比较图。
具体实施例方式本发明的方法主要包括如下四个部分
I、收集新鲜棉花叶并粉碎收集转Bt基因抗虫棉及其亲本的新鲜棉花叶，于冰箱内在-10°C冷冻24小时后粉碎，颗粒直径小于O. 03mm。2、收集新鲜牛粪新鲜牛粪中不包含任何大型分解者，避免其他分解者与目标粪甲虫的相互关系而影响检测结果。3、新鲜牛粪与粉碎棉花叶均匀混合将不含其它分解者的新鲜牛粪与粉碎的棉花叶按照一定比例充分混合。4、检测时间检测开始后的第7、第14和第21天。5、检测项目成虫死亡率,产卵率和卵化率。
实施例2012年8月底，收获转Bt基因棉花品种(中30)及其亲本(中16)的棉花叶各200g带回实验室，置于冰箱内于-10°C冷冻24小时后充分粉碎，颗粒直径小于O. 03mm。将粉碎的棉花叶40g与360g新鲜牛粪均匀混合；将混合样400g装入网孔之间为O. 2mm的纱袋内，再将捕获的粪甲虫(游荡蜉金龟)8只接种入纱袋中，将纱袋密封后置于户外地表；分别于第7，第14和第21天记录纱袋中的甲虫卵，幼虫和成虫数量，计算其产卵率，卵化率和死亡率。结果显示，中30处理中的甲虫产卵率显著低于中16 (图I);两个棉花品种中的卵化率无明显差异(图2);在第7天，中30处理中的成虫死亡率显著高于于中16处理，至第14天，中30处理中的成虫死亡率达到100% (图3)。以上实验结果表明，转Bt基因棉花对粪甲虫具有明显的影响。因此，利用新鲜牛粪与粉碎棉花叶的混合物检测转Bt基因棉花对非靶标粪甲虫影响的方法是可行的，准确的，快速的。
权利要求
1.一种评价转基因棉花对粪甲虫影响的检测方法，其特征是利用粉碎棉花叶和新鲜牛粪的混合物饲养甲虫用于评价转Bt基因棉花对粪甲虫的影响，具体由以下步骤构成 (O收集新鲜棉花叶并粉碎收集转Bt基因抗虫棉及其亲本的新鲜棉花叶，于冰箱内在-10°C冷冻24小时后粉碎，颗粒直径小于O. 03mm ； (2)收集新鲜牛粪新鲜牛粪中不包含任何大型分解者，避免其他分解者与目标粪甲虫的相互关系而影响检测结果； (3)新鲜牛粪与粉碎棉花叶均匀混合将不含其它分解者的新鲜牛粪与粉碎的棉花叶按照9:1质量比充分混合； (4)检测时间检测开始后的第7、第14和第21天； (5)检测项目成虫死亡率，产卵率和卵化率。
2.权利要求I所述的一种评价转Bt基因棉花对粪甲虫影响的检测方法在转基因作物对粪甲虫群落影响的评价中的应用。
全文摘要
本发明属于转基因作物生态风险评价技术领域，具体涉及一种评价转基因棉花对粪甲虫影响的检测方法。以转Bt基因抗虫棉及其亲本和粪甲虫为检测对象，收集新鲜棉花叶，于冰箱内在-10℃冷冻24小时后粉碎，颗粒直径小于0.03mm；称取粉碎棉花叶与新鲜牛粪按一定比例均匀混合；将混合样装入网孔直径为0.2mm的纱袋内，接种粪甲虫后密封纱袋，置于户外地表；分别于第7，第14和第21天记录纱袋中的甲虫卵，幼虫和成虫数量，计算其产卵率，卵化率和成虫死亡率。转Bt基因抗虫棉处理中的甲虫成虫死亡率高，产卵率和卵化率低，说明转Bt基因抗虫棉对粪甲虫具有伤害作用。该检测方法准确，快速，成本低，便于应用。
文档编号A01K67/033GK102960312SQ20121050648
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者孙书存, 吴新卫, 曹瑞 申请人:南京大学