专利名称：一种小麦遗传转化方法
技术领域：
本 发明涉及ー种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。
背景技术：
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，是仅次于水稻的第二大粮食作物，在世界各地都被广泛种植。小麦是我国人民赖以为生的农作物，随着我国人口的増加和人民生活水平的提高，对小麦的产量和品质也提出了越来越高的要求。传统的常规育种已经不能满足对小麦的品种和品质的要求，转基因技术的发展打破了常规育种的限制，已经成功地在棉花、玉米、大豆、油菜等作物中培育出高产新品种，创造了良好的经济效益和社会效益。小麦由于转化效率较低，转基因株系较难获得，因而与其它作物相比分子育种相对落后。目前小麦的转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法、农杆菌法、电激转化法和PEG法。由于小麦原生质体再生困难，所以限制了电激转化法和PEG转化法的应用。花粉管通道介导的遗传转化是在植物授粉后将外源DNA片段通过花粉管通道导入胚囊，从而整合到受精卵基因组中，然后发育成种子。花粉管通道法简单易行，但转化后代性状变异复杂，后期筛选工作很困难，因而一直没有被广泛使用。农杆菌介导的小麦遗传转化一直是植物界研究的一道难题。人们对影响农杆菌介导小麦遗传转化的因素作了深入广泛的研究，包括小麦基因型、外植体源、预培养时间、侵染和共培养时间、こ酰丁香酮、农杆菌菌株、载体以及筛选剂等都会影响转化率。农杆菌法具有转基因低拷贝、遗传稳定、能够转化相对较大片段DNA以及成本低廉等优点，但存在受基因型限制、对组织培养技术依赖性强、转化频率不高以及起始外植体单一等问题，因而应用受到一定的限制。基因枪法是小麦转化中应用较为广泛的一种转化方法。基因枪转化法是借助高速运动的金属微粒使附着于其表面的核酸分子穿过受体的细胞壁，释放出的DNA分子，并且随机整合到植物基因组中，然后通过组织培养技术再生出植株。
发明内容
本发明的目的是提供ー种小麦遗传转化方法，具体来说涉及ー种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。本发明提供的小麦遗传转化方法，包括如下步骤( I)将小麦胚性愈伤组织进行预培养；(2)将含有目的基因的表达载体通过基因枪法导入完成步骤(I)的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因；(3)将完成步骤(2)的胚性愈伤组织进行恢复培养；(4)取完成步骤(3)的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35-55天(可为35-45天、45-55天、35天、45天或55天);所述筛选培养基中含有35_45mg じ1(可为37_43mg じ1、37-40mg じ1、40_43mg じ1、37mg L'40mg じ1 或 43mg Lベ)的潮霉素；
(5)取步骤(4)得到的胚性愈伤组织，在含有35-45mg じ1 (可为37_43mg じ1、37-40mg じ1、40_43mg じ1、37mg じ1、40mg じ1或43mg じ1)潮霉素的分化培养基上培养10-20天(可为10-15天、15-20天、10天、15天或20天)，得到产生芽点的胚性愈伤组织；(6)取步骤(5)得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15_25mg じ1 (可为17-23mg じ1、17-20mg じ1、20_23mg じ1、17mg じ1、20mg じ1 或 23mg じ1)潮霉素的分化培养基上培养30-60天(可为30-47天、47-60天、30天、47天或60天)，得到小苗；(7)取步骤(6)得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。所述步骤(I)中，所述预培养采用的培养基可为高渗培养基。所述步骤(I)中，所述预培养的条件为25°C黑暗培养4小吋。所述步骤(2)中，所述表达载体可为植物表达载体。所述表达载体具体可为 PUN1301载体、以pUN1301载体为骨架的载体、在PUN1301载体的多克隆位点插入外源基因得到的载体、PCAMBIA1301载体、以pCAMBIA1301载体为骨架的载体或在pCAMBIA1301载体载体的多克隆位点插入外源基因得到的载体。所述步骤(2)中，所述目的基因可为GUS基因。所述步骤(2)中，所述基因枪法的參数可为所述表达载体的浓度为lug/ul，采用
I.Oiim金粉和IlOOpsi可裂膜。所述PUN1301载体的构建方法如下以PCAMBIA1301载体为骨架载体，在其多克隆位点插入序列表的序列I所示的UbiPro (启动子)和序列表的序列2所示的Noster (终止子)。所述pUN1301载体的构建方法具体如下以PCAMBIA1301载体为骨架载体，将BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列I所示的UbiPix)(启动子)，将SacI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列2所示的Noster (终止子)。所述步骤(3)中，所述恢复培养采用的培养基为高渗培养基。所述步骤(3)中，所述恢复培养的条件为25°C黑暗培养12小吋。所述步骤(4)中，所述筛选培养基为在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素得到的
培养基。所述步骤(4)中，所述培养的条件为25°C黑暗培养，每10-15天更换新的筛选培养基并继代。所述步骤(5)中所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。所述步骤(5)中，所述培养的条件为25°C，光暗周期为12小时/12小时。所述步骤(6)中所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。所述步骤(6)中，所述培养的条件为25°C，光暗周期为12小时/12小时。所述步骤(7)中，所述培养的条件为25°C，光暗周期为12小时/12小时。所述小麦可为栽培或野生小麦品种、品系、育种材料或中间材料，具体可为小麦品种“京冬I号”或小麦品种“京花9号”。所述步骤(I)中，所述小麦胚性愈伤组织可为扩繁得到的小麦胚性愈伤组织；所述扩繁的方法如下将小麦胚性愈伤组织在胚性愈伤诱导培养基上25°C黑暗培养4-5个月，每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基。以上任一所述胚性愈伤诱导培养基的制备方法如下在MS培养基中加入2，4- ニ氯苯氧こ酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2，4-ニ氯苯氧こ酸的浓度为l-2mg じ1 (如
I.5_2mg じ1、I. 5mg じ1 或 2mg じ1)、谷氨酰胺的浓度为 200_700mg じ1 (如 300_700mg じ1、300_500mg *L \500-700mg L \500mg *L \300mg *L 1 或 700mg *L 0、水解酪蛋白的浓度为500-700mg じ1 (如 300-700mg r\300-500mg r\500-700mg L_\500mg U\300mg じ1或 700mg L 1X以上任一所述胚性愈伤增殖培养基的制备方法在MS培养基中加入2，4-ニ氯苯氧こ酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2，4-ニ氯苯氧こ酸的浓度为l-2mg じ1 (如1-1. 5mg じ1、I. 5_2mg じ1、如Img じ1、I. 5mg じ1或2mg じ1)、谷氨酰胺的浓度为200-700mg じ1 (如 300-700mg r\300-500mg r\500-700mg L_\500mg U\300mg じ1 或 700mg じ1)、水解酪蛋白的浓度为 500-700mg じ1 (如 300_700mg r\300-500mg じ1、500_700mg L \500mg L \300mg L 1 或 700mg L 1X以上任一所述高渗培养基的制备方法在所述胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0. 3-0. 8mol じ1 (如0. 3-0. 4mol じ1、0. 4-0. 8mol じ1、
0.3mol L \0. 4mol L 1 或 0. 8mol L 1X以上任一所述筛选培养基的制备方法在所述胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为35-45mg じ1 (可为37-43mg じ1、37_40mg じ1、40_43mg じ1、37mg じ1、40mg じ1 或 43mg じ1)。以上任一所述胚性愈伤分化培养基的制备方法在MS培养基中加入6-糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的浓度为0. 5-4mg じ1 (如I. 5-3mg じ1、
1.5_2mg じ1、2-3mg じ1、I. 5mg L'2mg じ1或3mg じ1、)、水解酪蛋白的浓度为500-700mg じ1 (如 200-500mg r\500-700mg !/1AOOmg L_\200mg じ1 或 700mg じ1)。以上任一所述生根培养基的制备方法在MS培养基中加入a-萘こ酸，使得a-萘こ酸的浓度为0. 5-1. Omg じ1 (如0. 5mg Lベ)。以上任一所述的方法均可用于小麦育种。以上任一所述MS培养基的制备方法具体为按照表I的加入量将各个组分溶于水并用水定容至1し。本发明提供的是ー种利用梯度筛选法提高基因枪法转化小麦的转化效率的方法。发明操作简单易行，转化效率高，转化后所得到转基因小麦幼苗生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。
图I为胚性愈伤诱导培养基上培养4-5个月后得到的愈伤组织的照片；A为照片；B为局部放大的照片。图2为高渗培养基上培养4小时后愈伤组织的照片。图3为筛选培养基上培养45天后抗性愈伤组织的照片。图4为培养基甲上培养15天后产生芽点的胚性愈伤组织的照片；A为照片;B为局部放大的照片。图5为培养基こ上培养47天时愈伤组织的照片。图6为生根过程中的小苗的照片。
图7为移栽至花盆后植株生长过程中的照片。图8为移栽至花盆后结实植株的照片。图9为培养基こ或培养基甲上培养3-4周时愈伤组织的照片。图10为⑶S染色后的照片。图11为实施例5的照片。图12为pCAMBIA1301载体的结构示意图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，具体步骤可參见((Molecular Cloning: ALaboratoryManual》(Smaorook, J.，Ressule L., David W.，Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。小麦品种“京冬I号”:參考文献《新农业》;题目冬小麦新品种——京冬I号；作者翟惠，期卷2003年09期44页。小麦品种“京花9号”:參考文献《麦类作物学报》，题目高产优质早熟冬小麦新品种一点花9号；作者刘建平张立全田立平苏青赵克勇单福华张立平赵昌平；期卷:2008年，28期5卷:921页。实施例I、培养基的制备本实施例的各个培养基的pH值均为5. 8，配制完成后120°C高压灭菌20分钟。一、MS培养基的制备每升MS培养基加入的各个组分及其加入量见表I。表I姆升MS培养基中各个溶质的含量
权利要求
1.一种小麦遗传转化方法，包括如下步骤 (1)将小麦胚性愈伤组织进行预培养； (2)将含有目的基因的表达载体通过基因枪法导入完成步骤(I)的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因； (3)将完成步骤(2)的胚性愈伤组织进行恢复培养； (4)取完成步骤(3)的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35-55天；所述筛选培养基中含有35-45mg L—1的潮霉素； (5)取步骤(4)得到的胚性愈伤组织，在含有35-45mg L_1W潮霉素的分化培养基上培养10-20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织； (6)取步骤(5)得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15-25mg-L^1潮霉素的分化培养基上培养30-60天，得到小苗； (7)取步骤(6)得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中，所述预培养采用的培养基为高渗培养基。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述恢复培养采用的培养基为高渗培养基。
4.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述筛选培养基为在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素得到的培养基。
5.如权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(5)和/或所述步骤(6)中，所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。
6.权利要求I至5中任一所述的方法在小麦育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法，包括如下步骤(1)将小麦胚性愈伤组织进行预培养；(2)将含有目的基因和潮霉素抗性基因的表达载体通过基因枪法导入胚性愈伤组织；(3)恢复培养；(4)在筛选培养基上培养35-55天；所述筛选培养基中含有35-45mg·L-1的潮霉素；(5)在含有35-45mg·L-1潮霉素的分化培养基上培养10-20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织；(6)在含有15-25mg·L-1潮霉素的分化培养基上培养30-60天，得到小苗；(7)在生根培养基上培养至生根。本发明操作简单易行，转化效率高，转化后所得到小麦幼苗生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。
文档编号A01H4/00GK102952823SQ20121050582
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者种康, 牛遇达, 李春华, 张景昱 申请人:中国科学院植物研究所