专利名称：利用改进的目的基因表达盒进行植物转化的方法
技术领域：
本发明涉及一种转化植物的方法，特别涉及一种将目的基因以DNA片段的形式(含有目的基因表达盒)导入目的植物中的方法。
背景技术：
基因枪转化法具有转化效率高、无宿主限制、简单易操作等优点，在小麦转化中得到广泛应用，目前小麦遗传转68. 8%是采用基因枪转化。而传统的小麦基因枪转化法多以环形载体转化为主，导致载体骨架序列伴随目的基因同时整合进植物基因组，外源片段拷贝数高，目的基因的低表达甚至外源基因沉默，同时，载体框架序列中含有的抗生素抗性基因增加了转基因植物的安全隐患。最近的研究还发现，载体骨架序列会引起外源基因发生不同程度的重排、断裂，导致遗传不稳定。早在1991年，Artelt等就指出，载体框架结构在转基因中都会产生负面影响，因此需要对经典的基因枪法进行改进和创新。Uze 等(Uz6, M, Potrykus, I and Sautter, C. Single-stranded DNA in thegenetictransformation of wheat(Triticum aestivum L.): transformation fequencyand intergrationpattern. Theor Appl Genet, 1999，99:487-495)在小麦中比较了 Bar 和GUS基因的环形质粒和最小表 达框(包括启动子、目的基因编码序列和终止子)的转化效率，结果表明线性最小表达框的转化效率高于环形载体。然而，目前国际上用最小表达框转化法获得转基因小麦的成功报道还很有限，如何进一步提高最小表达框转化技术的转化效率，提高转化基因的表达效率及稳定性仍然需要研究。核基质结合区SAR (Scaffold Attachment Region)可作为DNA的边界兀件与核基质结合，使两个SAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环状结构，从而阻挡邻近染色质区的作用与影响，可以提高外源基因的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种转化植物的方法。本发明所提供的转化植物的方法，包括将目的基因导入目的植物中的步骤；所述目的基因是通过如下DNA片段(含有目的基因表达盒)导入目的植物中的(即导入目的植物中的是线性的DNA片段)5’-核基质结合区序列-启动子-目的基因-终止子-核基质结合区序列_3’，即所述DNA片段从上游至下游依次由核基质结合区序列、启动子、目的基因、终止子和核基质结合区序列组成。在上述方法中，所述核基质结合区序列来源于烟草(如烟草品种W38)基因组，所述核基质结合区序列具体如序列表中序列I所示。所述启动子可为Ubiquitin启动子。在本发明的一个实施例中，所述Ubiquitin启动子来源于载体pAHC25,所述Ubiquitin启动子的序列具体如序列表中序列2所示。所述终止子可为NOS终止子。在本发明的一个实施例中，所述NOS终止子来源于载体pAHC25，所述NOS终止子的序列具体如序列表中序列3所示。在本发明的一个实施例中，所述植物为小麦，具体为小麦(Triticum aestivumL.)品种科农199或济麦22。在本发明的一个实施例中，所述目的基因为GUS基因，所述GUS基因来源于载体PAHC25 ;在本发明的另一个实施例中，所述目的基因为GmDREB3基因。更加具体的，所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所不；所述GUS基因的序列如序列表中序列5所示。在实际应用中，所述DNA片段是与抗性筛选基因共同导入到所述目的植物中的。所述抗性筛选基因是以抗性基因表达盒的形式导入所述目的植物中的。所述抗性基因表达盒自5’端至3’端，依次由启动所述抗性基因转录的启动子、所述抗性基因，以及终止所述抗性基因转录的终止子组成。在本发明的一个实施例中，所述抗性基因为Bar基因；启动所述Bar基因转录的启动子为Ubiquitin启动子；终止所述Bar基因转录的终止子为NOS终止子。在上述方法中，所述转化为基因枪转化。本发明所提供 的转化植物的方法在培育转基因植物中的应用，也属于本发明的保护范围。本研究在最小表达框(启动子-目的基因编码序列-终止子)两端加SAR序列。通过转化GUS报告基因比较了不加SAR序列的线性载体与加SAR序列的线性载体的转化效率及GUS基因的表达稳定性。同时，采用加SAR序列的线性载体转化抗逆相关基因GmDREB3，通过PCR的方法鉴定转基因小麦中插入片段的完整性，结果表明，本研究改进的最小表达框转化技术可以提闻小麦基因枪转化效率，同时，提闻了目的基因在转基因小麦中的表达效率及遗传稳定性，且片段完整性良好。改进的最小表达框转化技术为获得安全转基因小麦提供了新思路。
图1为重组表达载体pS⑶S的酶切鉴定图。其中，A为KpnI和SpeI双酶切，泳道I为DNA分子量标准DL10000，泳道2为pS⑶S质粒经Kpn1、SpeI双酶切，泳道3为pS⑶S质粒对照，泳道4为DNA MarkerIII ；B为SacI和BamH I双酶切，泳道M为DNA Marker III，泳道1-2为pS⑶S质粒经Sac1、BamHI双酶切，泳道3为pS⑶S质粒对照。图2为重组表达载体pS⑶S中线性片段pS⑶S的结构示意图。其中，在与EcoRV相邻的下游有一个HindIII酶切位点，在与Kpn I相邻的上游有一个Xho I酶切位点未在图中显示。图3为重组表达载体pSHGmDREB3中线性片段pSHGmDREB3的结构示意图。其中，在与EcoR V相邻的下游有一个Hind III酶切位点，在与Kpn I相邻的上游有一个Xho I酶切位点未在图中显示。图4为EcoRI单酶切pAHC25质粒结果。泳道I为DNA分子量标准DL10000 ;泳道2为pAHC25质粒经EcoRI酶切的结果；泳道3为pAHC25质粒对照；泳道4为DNA MarkerIII。图5为获得转线性片段PS⑶S的转基因小麦的过程。A为培养；B为壮苗；C为移栽。
图6为Ttl及T1代转线性片段pS⑶S的小麦PCR检测结果(⑶S基因检测)。其中，A为转线性片段pS⑶S的Ttl代小麦PCR检测结果，泳道1-2为阳性植株，泳道3为阴性对照，泳道4为受体亲本科农199，泳道5为质粒对照pAHC25，泳道M为DNA分子量标准DL2000 ；B为转线性片段PS⑶S的T1代小麦PCR检测结果，泳道M为DNA分子量标准DL2000，泳道1_9为阳性植株，泳道10为阴性对照，泳道11为受体亲本科农199，泳道12为质粒对照pAHC25。图7为转线性片段PSGUS的小麦不同部位不同时期GUS报告基因表达检测结果。其中，A为Ttl代转基因小麦根部染色结果；B为T1代转基因小麦胚乳染色结果；C为T1代转基因小麦小花染色结果。M2-1、M2-2、M2-3、M2-4表示四个PCR阳性的转基因株系，kenongl99为受体亲本科农199。图8为转线 性片段pSHGmDREB3的小麦的分子检测结果。其中，A为利用引物GmDREB3-F2和GmDREB3_R2进行PCR的检测结果，泳道M为DNA分子量标准DL2000，泳道1-6为阳性株系，泳道7为阴性对照，泳道8为受体亲本济麦22，泳道9为质粒对照；B为利用引物DREB3-F1和DREB3-R1进行RT-PCR的检测结果，泳道M为DNA分子量标准DL2000，泳道1-5为阳性株系，泳道6为阴性对照，泳道7为受体亲本济麦22，泳道8为质粒对照；C为转线性片段pSHGmDREB3的小麦插入片段5’端完整性检测结果(引物A2和Cl)，泳道M为DNA Markerlll，泳道1_4为阳性株系，泳道5为阴性对照，泳道6为受体亲本济麦22，泳道7为质粒对照；D为转线性片段pSHGmDREB3的小麦插入片段3’端完整性检测结果(引物BI和D1)，泳道M为DNA Markerlll，泳道1_4为阳性株系，泳道5为阴性对照，泳道6为受体亲本济麦22，泳道7为质粒对照。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。烟草(Nicotiana tabacum L.)品种W38 :记载在“王卫锋,太帅帅，王鲁,刘贯山，李凤霞，高晓明，孙玉合，烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化，2011，中国烟草科学，32 (4):31-35”一文中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。其生长条件设置如下光照长日照设为16h光照/8h黑暗，短日照设为IOh光照/14h黑暗；温度为21。。。大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号记载在“邵桂花,常汝镇，陈一舞，闻淑荣，大豆耐盐性遗传的研究，1994，作物学报，20 (6):721-726” 一文中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。小麦(Triticum aestivum L.)品种科农199 :记载在“李俊明张相岐张爱民王志国安调过纪军王静，高产广适小麦新品种——科农199，2007，麦类作物学报，27 (2) :368”一文中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。小麦(Triticum aestivum L.)品种济麦22 :记载在“殷贵鸿李根英何中虎刘建军王辉夏先春，小麦新品种济麦22抗白粉病基因的分子标记定位，2009，作物学报，35 (8)1425-1431” 一文中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。载体pBluescriptSK :购自 Biovector CO. , LTD 公司，货号 BiovectorOO8 ；载体pAHC25 :记载在“张志云，张虎生，孙毅，梁爱华，双价抗虫基因植物表达载体的构建，2004，西北植物学报，24 (8) :1402-140”一文中，公众可从中国农业科学院作物科学
研究所获得。实施例1、含有目的基因表达盒的重组表达载体的构建一、设计引物对载体pBluescriptSK和pAHC25进行酶切位点分析,根据不同目的设计引物(表I)，而小麦内标基因 puroindoline-b 序列参考 LI 等(Li Z-ff, Hansen J L, Liu Y, RobertS，Zemetra R S and Berger P H. Using Real-Time PCR to Determine Transgene CopyNumberin Wheat. Plant Mol Biol R印，2004，22:179-188)报道设计引物。表I目的基因片段及其对应扩增引物序列
权利要求
1.转化植物的方法，包括将目的基因导入目的植物中的步骤；所述目的基因是通过如下DNA片段导入目的植物中的 5’ -核基质结合区序列-启动子-目的基因-终止子-核基质结合区序列-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述核基质结合区序列如序列表中序列I所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述启动子为Ubiquitin启动子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述Ubiquitin启动子的序列如序列表中序列2所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述终止子为NOS终止子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述NOS终止子的序列如序列表中序列3所示。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于所述植物为小麦。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的基因为GUS基因，或GmDREB3 基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所不；所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列5所不。
10.权利要求1-9中任一所述的方法在培育转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种转化植物的方法。该方法包括将如下DNA片段导入目的植物中的步骤5’-核基质结合区序列-启动子-目的基因编码序列-终止子-核基质结合区序列-3’。本发明通过转化GUS报告基因比较了不加SAR序列与加SAR序列的线性载体的转化效率及GUS基因的表达稳定性。同时，采用加SAR序列的线性载体转化抗逆相关基因GmDREB3，通过PCR的方法鉴定转基因小麦中插入片段的完整性，结果表明，本发明改进的最小表达框转化技术可提高小麦基因枪转化效率；同时，提高了目的基因在转基因小麦中的表达效率及遗传稳定性，且片段完整性良好；本发明为获得安全转基因小麦提供了新思路。
文档编号A01H5/00GK103045648SQ20121055480
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年10月31日
发明者陈明, 徐惠君, 马有志, 徐兆师, 李连城, 苏瑞波, 杜丽璞 申请人:中国农业科学院作物科学研究所