专利名称：一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法。
背景技术：
1977年Ackermann等首先用Ri质粒转化烟草细胞获得再生植株，开创了植物转基因的历史。此后，有多种技术被发明并应用于植物转基因，主要有农杆菌介导法、基因枪法、原生质体法和花粉管通道法，另外还有病毒介导法、电击法、显微注射法、超声波导入法、吸涨法、花粉携带法、脂质体法、激光微束穿刺法、离子束法等，应用这些方法，已有大量的植物物种被转化成功并产生了转基因植株。这些转化方法，一般是一次将一个目的基因导入植物细胞、并使其稳定整合到植物基因组中。为了提高农作物的产量或其它农艺性状，常需要将几个基因导入到受体植物中，采用普通转基因方法只能采用分多次、每次转入一个基因的策略，转化效率较低，因此，产生了一些多基因转化方法，一是在构建转化载体时，将多个基因表达框串联到T-DNA区上，该技术构建载体比较繁琐，受Ti质粒容量的限制无法构建包含大于50Kb插入序列的载体；二是将不同外源基因分别构建到不同表达载体上的T-DNA区域，然后将含不同基因的表达载体转入同一农杆菌细胞中，进行多基因转化，但采用这种方法时需要考虑农杆菌容纳多个质粒的能力。此外还可以通过其它策略将多个转基因导入同一植物材料中，例如将含有不同转基因的植物进行杂交，但这些方法不可避免的需要多个植物生长周期才能实现。很多基因的表达具有组织特异性，某些淀粉合成、谷蛋白合成相关基因仅在禾谷类作物的种子中特异表达，其产物主要催化各种淀粉和谷蛋白的合成，它们构成了胚乳的主要成分，这些基因的组织特异性表达是由其启动子的特异性决定的，如:小麦高分子量谷蛋白(HMW)启动子、大麦D组醇溶蛋白(D-hordin)启动子、大麦B组醇溶蛋白(B-hordin)启动子、水稻谷蛋白(Gtl)启动子、大麦异淀粉酶(Isa)启动子等。在禾谷类作物的种子中，往往大量积累淀粉，与淀粉合成相关的基因，也在胚乳发育时期特异的大量表达，其中比较重要的关键酶或限速酶基因有:蔗糖合成酶基因(Shl)；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大、小亚基，分别由Sh2和Bt2基因编码；颗粒结合型淀粉合成酶(GBSSIIa)基因，决定直链淀粉的合成。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法，为如下I)或2):1)为将腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物；
2)为将筛选标记蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物。上述方法中，所述筛选标记蛋白为PPT (它是Bar基因的蛋白表达产物，英文名Phosphinothricin N-acety I transferase,中译草丁勝N-乙酸转移酶)，其氨基酸序列为序列表中序列6 ； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基为Bt2，其氨基酸序列为序列表中序列
7；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基为Sh2，其氨基酸序列为序列表中序列
8；所述蔗糖合成酶为Shl，其氨基酸序列为序列表中序列9 ；所述颗粒结合型淀粉合成酶为GBSSIIa，其氨基酸序列为序列表中序列10。所述筛选标记蛋白基因具体为Bar，其核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第2036-2584位核苷酸；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因具体为Bt2，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1935-3362位核苷酸；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因具体为Sh2，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1085-2635位核苷酸；所述蔗糖合成酶基因具体为Shl，其核苷酸序列具体为序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸；所述颗粒结合型淀粉合成酶基因具体为GbssIIa，其核苷酸序列具体为序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。上述方法中，所述筛选标记蛋白基因以Bar基因表达盒的形式导入目的植物；所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因以Bt2基因表达盒的形式导入目的植物；所述Bt2基因表达盒具体包括Gtl启动子、Bt2基因和35S终止子；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因以Sh2基因表达盒的形式导入目的植物；所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子；所述蔗糖合成酶基因以Shl基因表达盒的形式导入目的植物；所述Shl基因表达盒具体包括Blhordein启动子、Shl基因和35S终止子；所述颗粒结合型淀粉合成酶基因以GbssIIa基因表达盒的形式导入目的植物；所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子。上述表达盒中的基因的序列均为基因编码区序列。上述方法中，所述Bar基因表达盒通过重组表达载体pTRAuxBar导入目的植物中；所述Bt2基因表达盒通过重组表达载体pGtl_Bt2导入目的植物中；所述Sh2基因表达盒通过重组表达载体pISA_Sh2导入目的植物中；所述Shl基因表达盒通过重组表达载体pBlhor-Shl导入目的植物中；所述GbssIIa基因表达盒通过重组表达载体pHMW-GbssIIa导入目的植物中。
上述方法中，所述组织为种子的胚乳；所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物。在本发明的实施例中采用的单子叶植物为玉米，具体为玉米H99。本发明的另一个目的是提供一种向目的植物中共转入多个目的基因的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:I)分别制备混合载体和转基因受体:所述混合载体由等摩尔比的多个重组表达载体组成；每个所述重组表达载体含有对应的一个所述目的基因的载体；所述转基因受体按照如下方法制备:Ajf目的植物的外植体进行预培养，得到预培养后外植体；B、将所述预培养后外植体进行高渗预培养，得到高渗预培养后外植体，即为转基因受体； 2)将所述混合载体包被金粉，再通过基因枪导入所述转基因受体中，得到轰击后外植体；3)将所述轰击后外植体依次进行传代培养、筛选培养、分化培养和生根培养,即得到转基因植物，实现向目的植物中共转入多个目的基因。上述方法中，步骤I)中，所述预培养采用的培养基为愈伤组织诱导培养基N6E，所述愈伤组织诱导培养基N6E按照如下方法制备:向N6基本培养基中添加终浓度为2.76g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为25uM硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；所述高渗预培养采用的培养基为N60SM培养基，所述N60SM培养基按照如下方法制备:向N6基本培养基中添加终浓度为0.69g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为36.4g/L山梨醇、终浓度为36.4g/L甘露醇、终浓度为29mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；步骤2)中，所述金粉与所述混合载体的质量比为20:1-500:1 ;在本发明的实施例中为100:1 ；基因枪真空度27 28psi,用650psi和IlOOpsi可裂膜各轰击一次,可裂膜至革巴点距离:6cm/9cm ；步骤3)中，所述传代培养为将所述轰击后外植体进行传代培养，得到传代培养外植体；所述传代培养采用的培养基为所述愈伤组织诱导培养基N6E ；所述筛选培养为将所述传代培养外植体进行筛选培养(除草剂筛选)，得到愈伤组织(抗除草剂biolaphos)；所述筛选培养采用的培养基为N6S培养基；所述N6S培养基按照如下方法制备:向N6基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为2mg/LBialaphos(双丙胺膦)、终浓度为6mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；所述分化培养为将所述愈伤组织进行分化培养，得到带有幼叶的愈伤组织(包括地上部分幼叶和地下部分的愈伤组织);
所述分化培养采用的培养基为RMI培养基；所述RMI培养基按照如下方法制备:向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为3mg/L Bialaphos (双丙胺膦)、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积；所述生根培养为将所述带有幼叶的愈伤组织进行生根培养，即得到转基因植物；所述生根培养采用的培养基为RMII培养基；所述RMII培养基按照如下方法制备:向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积。上述方法中，步骤I)中，所述预培养的条件为25_28°C、暗培养1_3天；所述预培养的条件具体为28°C、暗培养3天；所述高渗预培养的条件为25_28°C、暗培养4_10h ;所述高渗预培养的条件具体为28°C、暗培养8h ；步骤3)中，所述传代培养的条件为25_28°C暗培养14_21天；所述传代培养的条件具体为28°C暗培养14天；每一次所述筛选培养的条件为25_28°C暗培养2_3周，所述筛选次数为3_6次；所述分化培养的条件为23_25°C、暗培养1_3周；所述分化培养的条件具体为25 °C、暗培养3周；所述生根培养的条件为22-25 °C、16h光/8h暗培养15天、光照强度为4000-80001ux ;所述生根培养的条件具体为25°C、光照强度为40001ux ；在步骤2)和步骤3)之间还包括如下步骤:将所述轰击后外植体经过再次高渗预培养；所述再次高渗预培养采用的培养基为N6S0M培养基，所述再次高渗预培养的条件为25-28°C暗培养12-24h ;所述再次高渗预培养的条件具体为28°C再次高渗预培养20h ；所述目的植物为授粉后12天植物。上述方法中，所述目的植物为双子叶或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米，具体为玉米H99 ;所述外植体为种子的胚(授粉后12天植物种子的幼胚)；所述多个目的基因为筛选标记蛋白基因Bar、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因Bt2、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因Sh2、蔗糖合成酶基因Shl和颗粒结合型淀粉合成酶基因GbssIIa共5个基因；所述多个重组表达载体为pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl 和pHMW-GbssIIa共5个重组表达载体；所述重组表达载体pTRAuxBar为含有Bar基因表达盒的重组载体；所述重组表达载体pGtl_Bt2为含有Bt2基因表达盒的重组载体，为将序列表中序列2自5’末端第34-3362位核苷酸所示的Bt2基因表达盒中的Gtl启动子和Bt2基因插入pB7RWG2载体(attBl和attB2位点间)得到的载体；具体构建方法见实施例1的一的2)得到；
`
所述重组表达载体pISA_Sh2为含有Sh2基因表达盒的重组载体；为将序列表中序列3自5’末端第28-2635位核苷酸所示的Sh2基因表达盒的中的ISA启动子和Sh2基因编码区插入PB7RWG2载体(attBl和attB2位点间);具体构建方法见实施例1的一的3)得到；所述重组表达载体pBlhor-Shl为含有Shl基因表达盒的重组载体；为将序列表中序列4自5’末端第28-3000位核苷酸所示的Shl基因表达盒中的Blhordein启动子和Shl基因编码区连入PB7RWG2载体(attBl和attB2位点间)得到的载体；具体构建方法见实施例I的一的4)得到；所述重组表达载体pHMW-GbssIIa为含有GbssIIa基因表达盒的重组载体；为将序列表中序列5自5’末端第28-2307位核苷酸所示GbssIIa基因表达盒中的HMW-Glutenin启动子和GbssIIa基因编码区插入pB7RWG2载体(attBl和attB2位点间)得到的载体；具体构建方法见实施例1的一的5)得到。所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子；所述Bt2基因表达盒具体包括Gtl启动子、Bt2基因和35S终止子；所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子；所述Shl基因表达盒具体包括Blhordein启动子、Shl基因和35S终止子；所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子。所述Bar基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列I ;所述Bt2基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述Sh2基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述Shl基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述GbssIIa基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列5。用于多基因转化的表达盒组或用于多基因转化的重组表达载体组也是本发明保护的范围；或所述表达盒组或所述重组表达载体组在提高植物组织总淀粉含量中的应用也是本发明保护的范围；或用于多基因转化的培养基组也是本发明保护的范围；所述表达盒组为如下I)或2):I)由上述方法中的所述Bt2基因表达盒、所述Sh2基因表达盒、所述Shl基因表达盒和所述GbssIIa基因表达盒组成；2)由上述方法中的所述Bar基因表达盒、所述Bt2基因表达盒、所述Sh2基因表达盒、所述Shl基因表达盒和所述GbssIIa基因表达盒组成；所述重组表达载体组为如下a)或b):a)由上述方法中的 pGtl-Bt2、pISA-Sh2、pBlhor-Shl 和 pHMW-GbssIIa 组成；b)由上述方法中的 pTRAuxBar、pGtl-Bt2、pISA-Sh2、pBlhor-Shl 和 pHMW-GbssIIa组成；所述目的植物具体是双子叶植物或单子叶植物；所述组织具体为种子的胚乳；所述单子叶植物具体为玉米，具体为玉米H99。所述用于多基因转化的培养基组由上述方法中所述愈伤组织诱导培养基N6E、所述N60SM培养基、所述N6S培养基、所述RMI培养基和所述RMII培养基组成。为了克服以上传统单基因或多基因转化方法效率低、可共转化基因少的缺陷，本发明以基因枪法转化技术为基础，采用多种质粒，其中每种质粒含有一个不同的目的基因表达盒，将这些质粒等摩尔比例混合 、包被在金粉表面，并用基因枪轰击、转化受体植物材料，采用优化的组织培养体系，经过抗除草剂筛选、植物组织培养和植株再生、外源基因整合检测、外源基因表达检测和种子淀粉含量检测等步骤，建立起了高效的多基因共转化体系，并得到可稳定遗传、表达的多基因共转基因闻淀粉植株。本发明的实验证明，一方面，采用本发明的方法，可通过一次基因枪轰击，一次性同时转入多个基因，得到转化率较高的多基因共转化再生植株；另外一方面，由于同时转入4种与淀粉代谢相关的基因和I种筛选标记基因，使得转基因再生植株的总淀粉含量含量高于野生型植物；总之，本发明的方法不仅可以将控制某种生物学性状的多个基因，甚至可以将一个代谢途径中的所有基因，都一次性、高效、稳定地转入到受体材料中，极大地提高了转基因效率；而且可以得到高 淀粉含量的转基因植物。
图1为⑶S染色结果图2为试纸条检测结果图3为T4代材料的Southern blot检测图4为不同转基因株系中5个基因的表达丰度图5为共转化的T4代种子总淀粉含量和直链淀粉含量测定，其中，a,b, c 代表统计学差异显著(Ρ〈0.05, Duncan’ s test)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、共同转5个基因的转基因植物的获得一、5个表达载体的获得5个转基因所需要的表达载体分别为pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl、pHMW-GbssIIa ;上述5个表达载体的具体组成部分见表I所示，构建上述5个表达载体所需的引物如表2所示。表I为多基因共转化使用的表达载体
权利要求
1.一种培育转基因植物的方法，为如下I)或2): 1)为将腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物； 2)为将筛选标记蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述筛选标记蛋白为PPT，其氨基酸序列为序列表中序列6 ； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基为Bt2，其氨基酸序列为序列表中序列7 ； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基为Sh2，其氨基酸序列为序列表中序列8 ； 所述蔗糖合成酶为Shl，其氨基酸序列为序列表中序列9 ； 所述颗粒结合型淀粉合成酶为GBSSIIa，其氨基酸序列为序列表中序列10 ； 所述筛选标记蛋白基因具体为Bar，其核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第2036-2584位核苷酸； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因具体为Bt2，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1935-3362位核苷酸； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因具体为Sh2，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1085-2635位核`苷酸； 所述蔗糖合成酶基因具体为Shl，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸； 所述颗粒结合型淀粉合成酶基因具体为GbssIIa，其核苷酸序列为序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述筛选标记蛋白基因以Bar基因表达盒的形式导入目的植物；所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因以Bt2基因表达盒的形式导入目的植物；所述Bt2基因表达盒具体包括Gtl启动子、Bt2基因和35S终止子； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因以Sh2基因表达盒的形式导入目的植物；所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子； 所述蔗糖合成酶基因以Shl基因表达盒的形式导入目的植物；所述Shl基因表达盒具体包括Blhordein启动子、Shl基因和35S终止子； 所述颗粒结合型淀粉合成酶基因以GbssIIa基因表达盒的形式导入目的植物；所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述Bar基因表达盒通过重组表达载体pTRAuxBar导入目的植物中； 所述Bt2基因表达盒通过重组表达载体pGtl-Bt2导入目的植物中； 所述Sh2基因表达盒通过重组表达载体pISA-Sh2导入目的植物中； 所述Shl基因表达盒通过重组表达载体pBlhor-Shl导入目的植物中；所述GbssIIa基因表达盒通过重组表达载体pHMW-GbssIIa导入目的植物中。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述组织为种子的胚乳； 所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物。
6.一种向目的植物中共转入多个目的基因的方法，包括如下步骤: O分别制备混合载体和转基因受体: 所述混合载体由等摩尔比的多个重组表达载体组成；每个所述重组表达载体含有对应的一个所述目的基因的载体； 所述转基因受体按照如下方法制备: A、将目的植物的外植体进行预培养，得到预培养后外植体； B、将所述预培养后外植体进行高渗预培养，得到高渗预培养后外植体，即为转基因受体； 2)将所述混合载体包被金粉，再通过基因枪导入所述转基因受体中，得到轰击后外植体； 3)将所述轰击后外植体依次进行传代培养、筛选培养、分化培养和生根培养，即得到转基因植物，实现向目的植物中共转入多个目的基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述预培养采用的培养基为愈伤组织诱导培养基N6E，所述愈伤组织诱导培养基N6E按照如下方法制备:向N6基本培养基中添加终浓度为2.76g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为25uM硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积； 所述高渗预培养采用的培养基为N60SM培养基，所述N60SM培养基按照如下方法制备:向N6基本培养基中添加终浓度为0.69g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为36.4g/L山梨醇、终浓度为36.4g/L甘露醇、终浓度为29mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积； 步骤2)中，所述金粉与所述混合载体的质量比为20:1-500:1 ； 步骤3)中，所述传代培养为将所述轰击后外植体进行传代培养，得到传代培养外植体； 所述传代培养采用的培养基为所述愈伤组织诱导培养基N6E ； 所述筛选培养为将所述传代培养外植体进行筛选培养，得到愈伤组织； 所述筛选培养采用的培养基为N6S培养基；所述N6S培养基按照如下方法制备:向N6基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为2mg/L双丙胺膦、终浓度为6mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积； 所述分化培养为将所述愈伤组织进行分化培养，得到带有幼叶的愈伤组织； 所述分化培养采用的培养基为RMI培养基；所述RMI培养基按照如下方法制备:向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为3mg/L Bialaphos、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积； 所述生根培养为将所述带有幼叶的愈伤组织进行生根培养，即得到转基因植物；所述生根培养采用的培养基为RMII培养基；所述RMII培养基按照如下方法制备:向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述预培养的条件为25-28°C、暗培养1-3天；所述预培养的条件具体为28 °C、暗培养3天； 所述高渗预培养的条件为25-28°C、暗培养4-10h ;所述高渗预培养的条件具体为28°C、暗培养8h ； 步骤3)中，所述传代培养的条件为25-28°C暗培养14-21天；所述传代培养的条件具体为28°C暗培养14天； 每一次所述筛选培养的条件为25-28°C暗培养2-3周,所述筛选次数为3-6次；每一次所述筛选培养的条件具体为28°C暗培养3周，所述筛选次数为3次； 所述分化培养的条件为23-25°C、暗培养1-3周；所述分化培养的条件具体为25°C、暗培养3周； 所述生根培养的条件为22-25°C、16h光/8h暗培养15天、光照强度为4000-80001ux ；所述生根培养的条件具体为25°C、光照强度为40001UX ； 在步骤2)和步骤3)之间还包括如下步骤:将所述轰击后外植体经过再次高渗预培养；所述再次高渗预培养采用的培养基为N6S0M培养基，所述再次高渗预培养的条件为25-28°C暗培养12-24h ;所述再次高渗预培养的条件具体为28°C再次高渗预培养20h ；所述目的植物为授粉后12天植物。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法,其特征在于: 所述目的植物为双子叶或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米；所述外植体为种子的胚； 所述多个目的基因为筛选标记蛋白基因Bar、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因Bt2、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因Sh2、蔗糖合成酶基因Shl和颗粒结合型淀粉合成酶基因GbssIIa共5个基因； 所述多个重组表达载体为 pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl 和pHMW-GbssIIa共5个重组表达载体； 所述重组表达载体pTRAuxBar为含有Bar基因表达盒的重组载体； 所述重组表达载体pGtl-Bt2为含有Bt2基因表达盒的重组载体； 所述重组表达载体pISA-Sh2为含有Sh2基因表达盒的重组载体； 所述重组表达载体pBlhor-Shl为含有Shl基因表达盒的重组载体； 所述重组表达载体pHMW-GbssIIa为含有GbssIIa基因表达盒的重组载体； 所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子； 所述Bt2基因表达盒具体包括Gtl启动子、Bt2基因和35S终止子； 所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子； 所述Shl基因表达盒具体包括Blhordein启动子、Shl基因和35S终止子； 所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子。
10.用于多基因转化的表达盒组或用于多基因转化的重组表达载体组；或所述表达盒组或所述重组表达载体组在提高植物组织总淀粉含量中的应用； 或用于多基因转化的培养基组； 所述表达盒组为如下I)或2): O由权利要求3或9所述方法中的所述Bt2基因表达盒、所述Sh2基因表达盒、所述Shl基因表达盒和所述GbssIIa基因表达盒组成； 2)由权利要求 3或9所述方法中的所述Bar基因表达盒、所述Bt2基因表达盒、所述Sh2基因表达盒、所述Shl基因表达盒和所述GbssIIa基因表达盒组成； 所述重组表达载体组为如下a)或b): a)由权利要求4 或 9 所述方法中的 pGtl-Bt2、pISA-Sh2、pBlhor-Shl 和 pHMW-GbssIIa组成； b)由权利要求4 或 9 所述方法中的 pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl 和pHMW-GbssIIa 组成； 所述目的植物具体是双子叶植物或单子叶植物；所述组织具体为种子的胚乳； 所述用于多基因转化的培养基组由权利要求7-9中任一所述方法中所述愈伤组织诱导培养基N6E、所述N60SM培养基、所述N6S培养基、所述RMI培养基和所述RMII培养基组成。
全文摘要
本发明公开了一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法。本发明提供一种培育转基因植物的方法，为将筛选标记基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物。本发明的实验证明，可通过一次基因枪轰击一次性转化同时转入多个基因，大大缩短转基因材料培育的周期和工作量，具体同时转入4种与淀粉代谢相关的基因，使得转基因再生植株的总淀粉含量高于野生型植物。
文档编号C12N9/12GK103173485SQ20131006934
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者庞劲松, 于晓明, 姜丽丽, 李宁, 于倩, 夏琼, 刘宝 申请人:东北师范大学