专利名称：一粒小麦成熟胚的组织培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一粒小麦成熟胚的组织培养方法。
背景技术：
—粒小麦(einkorn)是小麦属的二倍体种(2n=2x=14, AA),是小麦的重要基础物种。一粒小麦具有耐寒、耐旱特性，适宜在山区栽培，对土壤要求不高，并发现其具有抗锈病的抗源。小麦为六倍体植物，具有基因组庞大、重复序列多、基因克隆困难等特点。二倍体一粒小麦较普通六倍体小麦基因组小，是进行插入诱变以分离、克隆小麦基因的良好材料。 因此，建立高效稳定的一粒小麦成熟胚组织培养再生体系不仅能为二倍体小麦遗传转化提供參考，还能为小麦分子育种研究奠定基础。植物组织培养，特别是胚性细胞系的建立，作为植物遗传转化操作的主要基础，一直受到广泛关注。到目前为止，麦类组织培养成功的外植体包括幼胚、幼穗、花药、成熟胚、幼叶、子叶中层、种子、悬浮细胞、子房、茎尖、根尖分生组织和原生质体等。研究其愈伤组织分化情况，其中，幼胚被认为是最理想的外植体材料，愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，获得转基因小麦植株的报道基本以幼胚为受体。而幼胚取材受时间、空间和季节的限制，合适的取材时期难以把握，所取材料生理状态、发育阶段的一致性也不能很好保障，在一定程度上制约了遗传转化的有效开展与应用。成熟胚取材方便，不受季节、植株发育阶段等因素限制，能保证不同个体间生理状态的一致性，是开展遗传转化最为方便实用的受体。目前，鲜有关于麦类二倍体物种组织培养体系建立的报道，且一粒小麦成熟胚组织培养再生体系的建立尚处于起步阶段。因此，亟待建立一种高效稳定的一粒小麦成熟胚组织培养再生体系，为研究其遗传转化提供基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的一粒小麦成熟胚的组织培养方法。为了实现本发明目的，本发明的一粒小麦成熟胚的组织培养方法，其包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤。其中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I为在基础培养基中添加2，4-ニ氯苯氧こ酸(2，4-D)和/或6-糖氨基嘌呤(KT)后制成的pH值为5. 8-6. O的培养基；所述分化培养步骤中使用的培养基II为在基础培养基中添加α -萘こ酸(NAA) ,6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、6_苄氨基嘌呤(6-BA)、6_糖氨基嘌呤(KT)或2_轻こ基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为5. 8-6. O的培养基。所述基础培养液配方为(以水配制)NH4NO；,1600-〗670 mg/L
KNO31800-2000 mg/L
MgSO4-TH2O370-380 mg/L
KH2PO4160-180 mg/L
CaCl；-2H20420-440 mg/L
KI0.8-0.9 mg/L
H.vBO.i5-7 mg/L
MnS04.4H2()20-23 mg/L
ZnSO4-TH2O8-9mg/L
Na2Mo04-2H；00.2-0.25 mg/L
CuS04-5H2O0.02-0.025 mg/L
CoClyoH2O0.02-0.025 mg/し
FeSO4-TH2O27-28 mg/L
Na2-EDTA’2H2037-38 mg/L
飢醇100-105 mg/L
甘氨酸1-2 mg/L
盐酸硫胺素0.05-0.1 mg/L
盐酸吡哆醇0.4-0.5 mg/L
烟酸0.4-0.5 mg/L
脯氨酸500-550 mg/L
谷氨酰胺500-550 mg/L
天冬酰胺150-200 mg/L
水解酪蛋白250-300 mg/L
蔗糖55-60 g/L
植物凝胶2.4-2.5g/L所述基础培养液配方优选为(以水配制):NH4NO31650 mg/L
KNO；,1900 mg/L
MgSO4-TH2O370.6 mg/L
KH2PO4170 mg/L
CaCl2_2H20439.8 mg/L
KI0.83 mg/L
H3BO36.2 mg/L
MhS0j'4H2022.3 mg/L
ZnS(.V7H2(.)8.6 mg/L
Ν 2Μοθ4·2Η2θ0.25 mg/L
CuSO4-SH2O0.025 mg/L
CoCb/oH^O0.025 mg/L
FeS0447H027.8 mg/L
Na2-E<DTA-2H2037.3 mg/L
肌醇100 mg/L
甘氨酸2 mg/L
盐酸硫胺素0.1 mg/L
盐酸吡哆醇0.5 mg/L
烟酸0.5 mg/L
脯氨酸500mg/L
谷氨酰胺500 mg/L
天冬酰胺150 mg/L
水解酪蛋白300 mg/L
蔗糖60 g/L
植物凝胶2.4g/L前述方法中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I中2，4_D与KT的添加比例为2，4-D O. 5-lmg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，4-Dl_2mg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，4_D 3_4mg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，4-D5-6mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4_D 0. 5-lmg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-Dl-2mg/L+KT 0.卜0. 15mg/L、2，4_D 3_4mg/L+KT 0.卜0. 15mg/L、2，4-D5_6mg/L+KT
0.1-0.15mg/L、2，4-D0.5-lmg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，4_D l_2mg/L+KT 0.5-0. 6mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0. 5-0. 6mg/L 或 2，4_D 5_6mg/L+KT 0. 5-0. 6mg/L 等。前述方法中，所述分化培养步骤中使用的培养基II中NAA、ZT、6_BA、KT与CC的添加比例为KT O. 5-1. Omg/L、KT I. 0-2. Omg/L、KT 2. 0-3. 0mg/L、NAA 0. 5-1. 0mg/L+KT
1.0-2. 0mg/L、NAAO. 5-1. 0mg/L+ZT I. 0-2. 0mg/L、NAA 0. 5-1. Omg/L+6-BA I. 0-2. Omg/L、NAA 0. 5-1. Omg/L+6-BA I. 0-2. 0mg/L+KT I. 0-2. 0mg/L、ΝΑΑ0. 5-1. Omg/L+6-BA
I.0-2. Omg/L+KT I. 0-2. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L 或 NAA 0. 5-1. Omg/L+6-BA I. 0-2. Omg/L+KT I. 0-2. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L+CC I. 0-2. Omg/L 等。优选地，所述培养基I为基础培养基+2，4-D l-2mg/L+KT0-0. 05mg/L。所述培养基II 为基础培养液 +NAA O. 5-1. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L。前述方法中，种子消毒的方法为将一粒小麦成熟种子于水中浸泡16-18小时后，置于75-80%的酒精中处理O. 5-1. 5分钟，然后浸泡于O. 1-0. 15%的升汞中13-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。前述方法中，愈伤组织诱导培养的方法为将剥离得到的成熟胚，盾片朝上接种于培养基I上，置于24-25° C暗培养，得到成熟胚愈伤组织。前述方法中，分化培养的方法为将成熟胚愈伤组织转移至培养基II中，置于25。C，光照16小吋/天，光照强度为2000-30001ux，培养至出苗。前述方法中，生根培养的方法为将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，待长至苗高达6-9cm(如苗高8cm，根系发育良好)吋，进行炼苗(炼苗期间注意保湿，温度不能大于30°C ),3-5天后将植株移入大田中或进行温室培养。其中，所述生根培养基的配方为(以水配制)
NH4NO^800-835 mg/L
KNO3900-1000 mg/L
MgSO4-TH2Oj 85-190 mg/L
KH2PO480-90 mg/L
CaCl2-2H20210-220 mg/L
K I0.8-0.9 mg/L
H.^BOs5-6 mg/L
MnS04.4H2()20-23 mg/L
ZnSO4-TH2O8-9 mg/L
Na2Mo04-2H200.2-0.25 mg/L
CuS04-5H200.02-0.025 mg/L
CoCl2-OH2O0.02-0.025 mg/し
FeSO4-TH2O27-28 mg/L
Na-EDTA-2H2037-38 mg/L
.Μ.醇100-105 mg/L
甘氨酸1-2 mg/L
盐酸硫胺素0.05-0.1 mg/L
盐酸吡哆醇0.4-0.5 mg/L
烟酸0.4-0.5 mg/L
蔗糖25-30 mg/L
p 引哚丁酸0.5-1 mg/L
α-蔡乙缓0.5-1 mg/L
多效唾0.5-1 mg/L
植物凝胶2.4-2.5g/L本发明的优点在于本发明的一粒小麦成熟胚的组织培养方法，可显著促进一粒小麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生，并使出愈率和分化率得到了显著改善，进一步提闻植株再生率。
图I为一粒小麦AS 260成熟胚的愈伤诱导情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚愈伤诱导情況，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚愈伤诱导情況。图2为一粒小麦AS 262成熟胚的愈伤诱导情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚愈伤诱导情況，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚愈伤诱导情況。图3为一粒小麦AS 260成熟胚的分化情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚分化情況，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚分化情況。图4为一粒小麦AS 262成熟胚的分化情况；其中，A和B分别于2011年和2010年采集的利用本发明方法的成熟胚分化情況，C为2011年采集的利用常规方法的成熟胚分 化情況。图5为本发明的一粒小麦成熟胚组织培养再生方法的エ艺流程图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I 一粒小麦成熟胚的组织培养再生方法I. I诱导培养基(I)和分化培养基(II)的配制基础培养液，其配方为(以蒸馏水配制)
NH4NO31650 mg/L
KNO3丨 900 nig/L
MgSO4-VH2O370.6 mg/L
KH2PO4170 mg/L
CaCl2-2H20439.8 mg/L
KI0.83 mg/L
HVBO.,6.2 mg/L
MnS04.4H2022.3 mg/L
ZnSOr7H2O8.6 mg/L
Na2MoO4 ^H2O0.25 mg/L
C11SO4 5H2O0.025 mg/L
CoC1-6H200.025 mg/L
FeS04.7H2027.8 mg/L
Na2-EDTA-IH2O37.3 mg/L
肌醇100 mg/L
甘氨酸2 mg/L盐酸硫胺素0.1 mg/L
盐酸吡哆醇0.5 mg/L
烟酸0.5 mg/L
脯氨酸500mg/L 谷氨酰胺500 mg/L
天冬酰胺150 mg/L
水解酪蛋白300 mg/L
蔗糖60 g/L
植物凝肢2.4g/L愈伤组织诱导培养基I的配方为基础培养液+2，4-D 2mg/L, pH值5. 8。将上述配制的溶液置于高压灭菌锅中，103. 4kPa(l. 05kg/cm2)，121. 3°C，15分钟灭菌，冷却后即得愈伤组织诱导培养基I。分化培养基II的配方为基础培养液+NAA O. 5mg/L+ZT I. Omg/L, pH值5· 8。将上述配制的溶液置于高压灭菌锅中，103. 4kPa(l. 05kg/cm2)，121. 3°C，15分钟灭菌，冷却后即得分化培养基II。I. 2种子消毒处理从5种一粒小麦基因型(AS 260,AS 262,AS 263,AS 265和AS267，由四川农业大学小麦研究所提供)中，选取于2011年采集的籽粒饱满的一粒小麦成熟种子，用蒸馏水在室温下浸泡16-18小时后，用75%的酒精消毒I分钟，再用O. 1%的升汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。I. 3剥离种胚用消毒后的解剖刀剥取胚。I. 4愈伤组织诱导培养将浸泡处理后的种子，用解剖刀剥取胚，盾片朝上接种于愈伤组织诱导培养基I上，每皿接种40粒成熟胚，于25° C，黑暗培养2周，诱导愈伤组织的形成。一粒小麦AS 260的愈伤生长情况如图I所示(A和B分别于2011年和2010年采集)；一粒小麦AS 262的愈伤生长情况如图2所示(A和B分别于2011年和2010年采集)。I. 5分化培养将I. 4中获得的成熟胚愈伤组织，转入分化培养基II中，光强2000-3000lux，光照时间16小时/天，温度25°C，培养3周。一粒小麦AS 260的绿苗分化情况如图3所示(A和B分别于2011年和2010年采集)；一粒小麦AS 262的绿苗分化情况如图4所示(A和B分别于2011年和2010年采集)。I. 6生根培养将长出2-3片叶子的分化苗转移到生根培养基中培养，光强2000-30001ux，光照时间16小吋/天，温度25°C。待长至适宜大小(苗高8cm，根系发育良好)后打开试管进行炼苗(期间注意保湿，温度不能大于30°C )，3-5d后移栽入花盆，然后视外界温度高低决定移入温室或继续在人工气候箱24°C中生长。分别测定每个材料的成熟胚的再生率(成熟胚出苗率=生根植株数/接种愈伤数)。其中，5种一粒小麦基因型AS 260、AS 262、AS263、AS 265 和 AS 267 的再生率分别是AS 260 39. 5%、AS 262 44. 3%、AS 263 44. 1%、AS265 39. 7%, AS 267 39.6%。
所述生根培养基的配方为(以蒸馏水配制):
权利要求
1.一粒小麦成熟胚的组织培养方法，包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤，其特征在干， 所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I为在基础培养基中添加2，4- ニ氯苯氧こ酸(2，4-D)和/或6-糖氨基嘌呤(KT)后制成的pH值为5. 8-6. O的培养基；所述分化培养步骤中使用的培养基II为在基础培养基中添加α -萘こ酸(NAA) ,6-(4羟基_3_甲基-2_反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、6_苄氨基嘌呤(6-BA)、6-糖氨基嘌呤(KT)或2-羟こ基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为5. 8-6. O的培养基。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述基础培养基的配方为
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基 I 中 2,4-D 与 KT 的添加比例为2,4-DO. 5-lmg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，4_D ト2mg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，4-D3-4mg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，4_D 5_6mg/L+KT 0-0. 05mg/L、2，·4-DO.5-lmg/L+KT 0.1-0. 15mg/L、2，4_D l_2mg/L+KT 0.1-0. 15mg/L、2，4_D 3_4mg/L+KT·0. l-o.15mg/L、2，4-D 5_6mg/L+KT 0. 1-0.15mg/L、2，4_D 0.5-lmg/L+KT 0.5-0. 6mg/L、2，·4-D l-2mg/L+KT 0.5-0. 6mg/L、2，4_D 3_4mg/L+KT 0.5-0. 6mg/L 或 2，4_D 5_6mg/L+KT0.5-0. 6mg/L。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述分化培养步骤中使用的培养基 II 中 NAA、ZT、6-BA、KT 与 CC 的添加比例为KT O. 5-1. Omg/L、KT I. 0-2. Omg/L、KT 2. 0-3. Omg/L、NAAO. 5-1. Omg/L+KT I. 0-2. Omg/L、NAA 0. 5-1. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L、NAAO. 5-1. Omg/L+6-BA I. 0-2. Omg/L、NAA 0. 5-1. Omg/L+6-BAl. 0-2. Omg/L+KT1.0-2. Omg/L、NAA 0. 5-1. Omg/L+6-BAl. 0-2. Omg/L+KT I. 0-2. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L 或NAAO. 5-1. Omg/L+6-BA I. 0-2. Omg/L+KT I. 0-2. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L+CCl. 0-2. Omg/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基 I 为基础培养基 +2，4-D l-2mg/L+KT0-0. 05mg/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分化培养步骤中使用的培养基II为 基础培养液 +NAA O. 5-1. Omg/L+ZT I. 0-2. Omg/L。
7.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，种子消毒的方法为将一粒小麦成熟种子于水中浸泡16-18小时后，置于75-80%的酒精中处理0. 5-1. 5分钟，然后浸泡于0.1-0. 15%的升汞中13-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养的方法为将剥离得到的成熟胚，盾片朝上接种于培养基I上，置于24-25° C暗培养，得到成熟胚愈伤组织。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，分化培养的方法为将成熟胚愈伤组织转移至培养基II中，置于25° C，光照16小吋/天，光照强度为2000-30001ux，培养至出苗。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，生根培养的方法为将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，待长至苗高达6-9cm时，炼苗3-5天，最后将植株移入大田中或进行温室培养；其中，所述生根培养基的配方为NH4NO.,800-835 mg/LKNO3900-1000 mg/LMgSO4-VH2O185-190 mg/LKH2PO480-90 mg/LCaCl2_2H20210-220 mg/LKI0.8-0.9 mg/LH3BOi5-6 mg/LMnS04'4H2020-23 mg/LZnSO4-VH2O8-9 mg/LNa2Mo04'2H00.2-0.25 mg/LCuS04-5H00.02-0.025 mg/LCoClyoH2O0.02-0.025 mg/しFeS04.7Hj.027-28 mg/LNa-EDTA·2H37-38 mg/L飢100-105 mg/L甘氨酸1-2 mg/L盐酸硫胺素0.05-0.1 mg/L 盐酸吡哆醇0.4-0.5 mg/L烟酸0.4-0.5 mg/L蔗糖25-30 mg/Lp弓I 噪丁酸0.5-1 mg/La-萘乙酸0.5-1 mg/L多效 p坐0.5-1 mg/L植物凝胶2.4-2.5 g/L 以水配制《
全文摘要
本发明提供一粒小麦成熟胚的组织培养方法，包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤，其中愈伤组织诱导培养和分化培养步骤中使用的培养基分别为I和II。采用本发明方法，可显著促进一粒小麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生，并使出愈率和分化率得到了显著改善，进一步提高植株再生率。
文档编号A01H4/00GK102668982SQ20121016157
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月4日
发明者刘亚西, 江千涛, 王际睿, 郑有良, 马建, 魏育明 申请人:四川农业大学