专利名称：节节麦成熟胚的组织培养方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，具体地说，涉及节节麦成熟胚的组织培养方法。
背景技术：
节节麦(Aegilopstauschii, 2n=14, DD),是普通小麦(Triticurnaestivum, 2n=6x=42, AABBDD)D染色体组的供体物种。节节麦具有抗病、抗虫和耐胁迫等多种优良特性，是小麦遗传改良的重要基因资源。利用基因工程技木，对优异外源基因进行功能验证和遗传转化利用，日益受到人们的重视。但是，普通小麦是异源六倍体，遗传背景复杂，虽然遗传转化取得一定的进展，但转化效率仍远低于玉米和水稻。特别是对于基因功能验证，要求快捷的时效性。节节麦除了为普通小麦提供D染色体组外，与普通小麦的A、B染色体组具有高度同源性，仅包含一套基本染色体，遗传背景相对简单，适宜作为遗传转化的优良受体。因此，可以作为小麦基因功能验证的重要模式植物。 实现遗传转化的重要技术基础是组织培养体系的建立。目前，以幼胚、幼穗和成熟胚作为外植体进行的麦类遗传转化都获得了成功，其中，幼胚是转化成功最多的外植体。但幼胚的取材受季节限制，个体间生理状态一致性难以把握，短时间难以进行重复试验。成熟胚具有取材方便，不受季节、植株发育阶段等因素限制的特点，能保证不同个体间生理状态的一致性和提供足够愈伤数量，是开展遗传转化最为方便实用的受体。目前，关于节节麦成熟胚组织培养的研究，在国内外都未见报道。节节麦成熟胚组织培养体系尚处于初歩探索阶段，特别是针对成熟种子的表面消毒，減少愈伤组织培养过程中的污染，以及提高成熟胚绿苗分化能力等方面缺乏深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的节节麦成熟胚的组织培养方法。为了实现本发明目的，本发明的一种节节麦成熟胚的组织培养方法，其包括种子消毒、分离成熟胚并切除胚尖、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤。其中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为在基础培养基中添加2，4-ニ氯苯氧こ酸(2，4-D)、麦草畏(Dicamba)或6-糖氨基嘌呤(KT)中的ー种或多种后制成的PH值为6. O的培养基；所述分化培养步骤中使用的AtS为在基础培养基中添加α -萘こ酸(NAA)、6-(4羟基-3-甲基-2_反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)、6_糖氨基嘌呤或2-羟こ基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为6. O的培养基。上述基础培养基配方为(以水配制)KNO31500 mg/L
(NH4)2SO42300 mg/L
KH2PO42000 mg/L
CaCl2*2H20630 mg/L
MgSO4.7H20900 mg/L KI40 mg/L
MnS04*4H20220 mg/L
H3BO3500 mg/L
ZnS04*7H20800 mg/L
CoCMH2O0.025 mg/L
CuS04*5H200.025 mg/L
Na2Mo04*2H200.25 mg/L
FeS04*7H2027.8 mg/L
Na2-EDTA-2H2037.3 mg/L
肌醇100 mg/L
甘氨酸200 mg/L
盐酸硫胺素250 mg/L
盐酸吡哆醇25 mg/L
盐酸25 mg/L麟氨 _500 mg/L
昝氨酰胺500 mg/L
天冬氨酸150 mg/L
酪蛋白水解物300 mg/L
琼脂粉7g/L优选所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为基础培养基+2，4_ ニ氯苯氧こ酸2-6mg/L+麦草畏l-5mg/L+6-糖氨基嘌呤0-1. Omg/L。更优选地,所述AtEI培养基为基础培养基+2,4- ニ氯苯氧こ酸2mg/L+麦草畏2mg/L+6-糖氨基嘌呤O. 5mg/L。优选分化培养步骤中使用的AtS培养基为基础培养基+0-1. Omg/La -萘こ酸+6- (4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤l-5mg/L+6-苄氨基嘌呤0-2. Omg/L+6-糖氨基嘌呤0-1. Omg/L+2-羟こ基-三甲基氢氧化胆碱0-3. Omg/L。更优选地，所述AtS培养基为基础培养基+0. 5mg/L或I. Omg/L a -萘こ酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤2. Omg/L或4. Omg/L+6-糖氨基嘌呤I. Omg/L+2-轻こ基-三甲基氢氧化胆碱I. Omg/L。最优选地，所述AtS培养基为基础培养基+0. 5mg/L a -萘こ酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤4. Omg/L+6-糖氨基嘌呤I. Omg/L+2-羟こ基-三甲基氢氧化胆碱I. Omg/
し前述方法中，种子消毒的方法为将种子去壳后，浸泡于75%酒精中lmin，用无菌水冲洗3次后,置于25%次氯酸钠溶液中振荡处理20min，然后用无菌水冲洗3次，浸泡于无菌水中10-12h。前述方法中，愈伤组织诱导培养的方法为将切除胚尖的成熟胚，按胚轴向上接种在AtEI培养基上，置于25。C，暗培养15天，得到成熟胚愈伤组织。前述方法中，分化培养的方法为将成熟胚愈伤组织转移至AtS培养基中，置于25。C，光照16小吋/天，光照强度为4000-60001ux。培养至出苗。前述方法中，生根培养的方法为将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，当不定根长度达3-4cm时，将植株移入大田中培养。本发明的优点在于本发明的节节麦成熟胚的组织培养方法，可高效促进节节麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生，具有出愈率高、愈伤质量好的显著优势，增加产生不定芽的数目，提高植株再生率。
图I为节节麦AS2399成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的愈伤生长情况对比；其中，A为利用本发明方法的愈伤诱导情况；B为利用常规方法的愈伤诱导情况。图2为节节麦AS2407成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的愈伤生长情况对比；其中，A为利用本发明方法的愈伤诱导情况；B为利用常规方法的愈伤诱导情况。图3为节节麦AS2399成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的分化情况对比；其中，A为利用本发明方法的绿苗分化情况；B为利用常规方法的绿苗分化情况。图4为节节麦AS2407成熟胚在利用本发明方法和常规方法培养条件下的分化情况对比；其中，A为利用本发明方法的绿苗分化情况；B为利用常规方法的绿苗分化情况。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I节节麦成熟胚的组织培养再生方法I. I诱导培养基(AtEI)和分化培养基(AtS)的配制AtEI 诱导培养基KN03 1500mg、(NH4)2SO4 2300mg、KH2P042 0 00mg、CaCl2 · 2H20630mg、MgSO4 · 7H20 900mg、KI 40mg、MnSO4 · 4H20 220mg、H3BO3 500mg、ZnSO4 · 7H20 800mg、CoCl · 6H200. 025mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、FeSO4 · 7H2027. 8mg、Na2-EDTA ·2Η20 37. 3mg，用水定容至950ml，调节pH值至6. 0，加入琼脂粉7. Og,以上成分采用121°C高压灭菌20min，灭菌完成后，待温度降到60°C，将如下成分混合肌醇lOOmg、甘氨酸200mg、盐酸硫胺素250mg、盐酸卩比卩多醇25mg、烟酸25mg、脯氨酸500mg、谷氨酰胺500mg、天冬氨酸150mg、酪蛋白水解物300mg、2,4-D 2mg、Dicamba2mg、KT O. 5mg混合，并用水定容至50ml，过滤灭菌后添加到高压灭菌后的培养基中。AtS 分化培养基KN03 1500mg、(NH4)2SO4 2300mg、KH2P042 0 00mg、CaCl2 · 2H20630mg、MgSO4 · 7H20 900mg、KI 40mg、MnSO4 · 4H20 220mg、H3BO3 500mg、ZnSO4 · 7H20 800mg、CoCl · 6H200. 025mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、FeSO4 · 7H2027. 8mg、Na2-EDTA ·2Η20 37. 3mg，用水定容至950ml，调节pH值至6. 0，加入琼脂粉7. Og,以上成分采用121°C高压灭菌20min，灭菌完成后，待温度降到60°C，将如下成分混合肌醇lOOmg、甘氨酸200mg、盐酸硫胺素250mg、盐酸卩比卩多醇25mg、烟酸25mg、脯氨酸500mg、谷氨酰胺500mg、天冬氨酸150mg、酪蛋白水解物300mg、NAA O. 5mg、ZT4mg、6_BA为lmg, CC Img混合，并用水定容至50ml，过滤灭菌后添加到高压灭菌后的培养基中。I. 2种子消毒处理从6 种节节麦基因型(AS2386、AS2393、AS2399、AS2404、AS2405 和 AS2407，由四川农业大学小麦研究所提供)中，选取无病虫害的健康种子，将种子去壳后，用75%酒精消毒处理lmin，无菌水冲洗3次后，用25%次氯酸钠溶液振荡消毒处理20min，再用无菌水冲洗3次后，在室温下用无菌水浸泡10-12h。 I. 3愈伤组织诱导培养将浸泡处理后的种子，再用25%次氯酸钠振荡消毒15min，无菌水冲洗3次后，用刀片将成熟胚从种子中分离，并切除胚尖，按胚轴向上接种在AtEI诱导培养基上，每皿接种40粒成熟胚。将接种于AtEI诱导培养基的成熟胚置于25° C，暗培养15天后培养出愈伤组织。分别统计成熟胚胚性愈伤出愈率=胚性愈伤数/接种胚数6种节节麦基因型AS2386、AS2393、AS2399、AS2404、AS2405 和 AS2407 节节麦 AS2399 和 AS2407 的愈伤生长情况分别如图IA和图2A所示。I. 4分化培养将I. 3中获得的成熟胚愈伤组织，转入AtS分化培养基中，置于25° C，光照16小时/天，光照强度为4000-60001uX。培养3周后，开始出现绿苗。节节麦AS2399的绿苗分化情况如图4A所示；节节麦AS2399和AS2407的绿苗分化情况分别如图3A和图4A所示。I. 5生根培养当节节麦6 种基因型(AS2386、AS2393、AS2399、AS2404、AS2405 和 AS2407)各自成熟胚愈伤组织分化出的再生芽高度达2-3cm时，转入生根培养基中培养，2-3周后长出不定根，当不定根长度达到3-4cm时，取出植株，将根部培养基洗浄，移入土壌中培养。分别测定每个材料的成熟胚的再生率(成熟胚再生率=再生植株/接种愈伤数)。6种节节麦基因型 AS2386、AS2393、AS2399、AS2404、AS2405 和 AS2407 的成熟胚再生率分别为 52. 7%、41. 3%, 56. 3%, 52. 6%、61· 7%, 60. 8%。实施例2利用本发明方法对不同年份收获的种子进行成熟胚组织培养的情况比较I. I按照实施例I中方法对分别于2009年、2010和2011年收获的6种基因型(AS2386、AS2393、AS2399、AS2404、AS2405和AS2407)的节节麦进行种子处理、诱导培养、分
化培养及生根培养。I. 2不同年份收获的种子成熟胚组织培养的情况比较结果如表I所示表I不同年份收获的种子成熟胚组织培养的情况比较
种子收获时间节节麦基因型接种数麗性愈伤出愈率(％> 再生率(％)
权利要求
1.节节麦成熟胚的组织培养方法，包括种子消毒、分离成熟胚并切除胚尖、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤，其特征在干， 所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为在基础培养基中添加2，4-ニ氯苯氧こ酸、麦草畏或6-糖氨基嘌呤中的一种或多种后制成的pH值为6. O的培养基；所述分化培养步骤中使用的AtS培养基为在基础培养基中添加α -萘こ酸、6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤、6-苄氨基嘌呤、6-糖氨基嘌呤或2-羟こ基-三甲基氢氧化胆碱中的一种或多种后制成的pH值为6. O的培养基。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述基础培养基配方为
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为基础培养基+2，4- ニ氯苯氧こ酸2-6mg/L+麦草畏l_5mg/L+6-糖氨基嘌呤 0-1. Omg/L ο
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为基础培养基+2，4- ニ氯苯氧こ酸2mg/L+麦草畏2mg/L+6_糖氨基嘌呤O. 5mg/し
5.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在干，分化培养步骤中使用的AtS培养基为基础培养基+0-1. Omg/L α -萘こ酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤l_5mg/L+6-苄氨基嘌呤0-2. Omg/L+6-糖氨基嘌呤0-1. Omg/L+2-羟こ基-三甲基氢氧化胆碱0-3. Omg/L ο
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分化培养步骤中使用的AtS培养基为基础培养基+0. 5mg/L或I. Omg/L α -萘こ酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤2.Omg/L或4. Omg/L+6-糖氨基嘌呤I. Omg/L+2-轻こ基-三甲基氢氧化胆碱I. Omg/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分化培养步骤中使用的AtS培养基为基础培养基+0.5mg/L α-萘こ酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤4. Omg/L+6-糖氨基嘌呤I. Omg/L+2-轻こ基-三甲基氢氧化胆碱I. 0mg/Lο
8.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养的方法为将切除胚尖的成熟胚，按胚轴向上接种在AtEI培养基上，置于25。C，暗培养15天，得到成熟胚愈伤组织。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，分化培养的方法为将成熟胚愈伤组织转移至AtS培养基中，置于25° C，光照16小吋/天，光照强度为4000-60001ux。培养至出苗。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，生根培养的方法为将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，当不定根长度达3-4cm时，将植株移入大田中培养。
全文摘要
本发明提供一种节节麦成熟胚的组织培养方法，包括种子消毒、分离成熟胚并切除胚尖、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤，其中愈伤组织诱导培养和分化培养步骤中使用的培养基分别为AtEI和AtS。采用本发明方法，可高效促进节节麦成熟胚愈伤组织的形成和体细胞胚胎的发生，具有出愈率高、愈伤质量好的显著优势，增加产生不定芽的数目，提高植株再生率。
文档编号A01H4/00GK102668983SQ201210161579
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者刘亚西, 刘登才, 江千涛, 王际睿, 郑有良, 马建, 魏育明 申请人:四川农业大学