一种利用棉花不育系进行转基因棉花花粉漂移研究的方法

一种利用棉花不育系进行转基因棉花花粉漂移研究的方法
【专利摘要】本方法涉及一种防止转基因棉花通过花粉传播的方式进行基因漂移的一种生物隔离的有效方法。采用花期与棉花花期基本一致的蜜源植物，如薄荷、薰衣草、罗布麻、大亚白麻，补血草等种植于转基因棉花四周，作为转基因棉花的隔离带，它能够优先吸引蜜蜂主要采集蜜源植物花蜜，而不采集棉花的花蜜，从而有效的减少棉花花粉的异交率，防止转基因棉花对非转基因棉花的基因污染现象。其优点是开花时间主要集中在夏秋季、花期长、花香蜜浓，对授粉昆虫有更强的吸引力，能够减少转基因棉花种植时布局困难，更有利于转基因的棉花的种植和推广。
【专利说明】一种利用棉花不育系进行转基因棉花花粉漂移研究的方法
【技术领域】:
[0001]本方法属于转基因棉花基因漂移监测的方法，具体涉及应用棉花不育系结籽情况来监测花粉漂移，在种植转基因棉花的30米开外设置屏障，可以限制基因的漂流。
【背景技术】:
[0002]20世纪80年代以来，随着基因工程技术的不断发展，转基因植物及其产业化研究取得了令人瞩目的成就。据国际农业生物技术应用推广协会(ISAAA)统计，2008年全世界的转基因作物面积达到1.25亿hm2，比1996年增长了 74倍，比2007年增加了 9.4%。预计2010年全球转基因作物的交易额将达到100亿美元。人类对高产优质、抗病抗逆生物的需要，以及对低成本高产出的追求，无疑将促使转基因技术的深入研究和转基因植物的大规模产业化。目前，全球转基因作物种植面积最大的国家是美国，其次是巴西和阿根廷。世界大豆产量的77%来自转基因作物，世界棉花产量的48%是转基因的，转基因玉米和油菜的比例分别超过25%和20%。
[0003]转基因生物技术的快速发展和转基因作物的不断培育为全球特别是第三世界国家的粮食安全和保障带来了新的机遇。但是，快速增长的种植面积和越来越多的转基因作物的环境释放以及商品化生产也引起了全世界范围内对转基因作物生态安全的关注，其中包括转基因作物是否会发生基因漂移(gene flow)，外源基因能否通过花粉传播等途径转移到非转基因作物及其近缘野生种等问题。
[0004]在大量转基因植物产业化及转基因产品商品化的同时，人们对转基因植物及其产品的安全性越来越受重视。引发了世界各国对转基因植物的生态影响、转基因食品安全性等方面问题的激烈争论，甚至进一步引发了欧盟和美国的农产品进出口贸易战。安全性评价主要包括受体植物安全性风险、生态环境安全性风险和毒理安全性风险等。其中，对转基因植物外源基因逃逸风险评估是生态环境安全性评估重要内容之一。根据花粉转播的最远距离，可以确定适当的隔离带，以降低转基因作物花粉对非转基因植物及近缘种的污染。基因漂移是一种生物的目标基因向附近移风险区域相关近缘种的自发转移，能导致相关近缘种发生内在的基因变化，使其具有目标基因的一些优势特征，从而形成新的物种，以致整个生态环境发生结构的变化。花粉传播是转基因作物外源基因漂移的主要途径，花粉可以借助风和昆虫发生转移。在转基因作物和近缘种杂交亲和的情况下，就会发生基因漂移。近年来，国内外学者对此开展了广泛的研究。研究表明，棉花、高梁、粟、马铃薯、油菜、甜菜、向日葵、西瓜、芥菜和拟南芥等转基因作物花粉转播距离为10~1000m。
[0005]根据大量的研究数据，不少国家转基因作物安全管理部门对转基因和相应非转基因作物间的隔离距离及隔离措施提出了相应要求或建议。如我国在1996年首次出台的农业转基因生物安全管理条例中，曾提出了不同转基因作物的参考隔离距离，如水稻100m，玉米(Zea mays) 300m,大豆 100m,棉花(Gossypium hirssittum) 150m,油菜 1000m (中国农业部，1996)。
[0006]由于棉花花朵大、色泽鲜艳，有4种蜜腺，易招引蜜蜂等昆虫采蜜，当昆虫在转基因棉花上采粉后再到非转基因棉花上采粉就无形中将转基因棉花的花粉带到非转基因棉花上，从而造成了异花授粉和外源基因的漂流。因此，对于转基因抗虫棉的研究表明，无论是从国外引进的和我国自己培育的转Bt基因抗虫棉和转tfdA基因抗除草剂棉花，监测了外源Bt基因和tfdA基因向周围环境遗传漂流的频率和距离。结果表明；无论是我国自行培育的转基因棉花，还是从国外引进的转基因棉花；无论是转Bt基因棉花，还是转tfdA基因棉花，导入到棉株体内的外源基因均可向周围环境漂流，其最高漂流频率为10.48%，最远漂流距离可达50m.防止外源基因向周围环境扩散的最有效方法是设置一定的隔离带，隔离带的距离以50~100m为好。我们的研究也表明，在正常的管理条件下，在新疆北疆生态隔离的距离是30-50m。
[0007]当前，植物花粉散布和基因流监测的方法主要包括荧光标记法、放射标记法、中子活化轰击法、花粉粒染色法和遗传标记法。就转基因植物的田间监测来说，对于一些花形较大的转基因植物，花粉粒染色标记法直接观察相对简单。其它方法皆为利用遗传标记法则可直接检测非转基因植物子代中是否含有转基因植物的目的基因，因而可以直接追踪目的基因的基因流。
[0008]本发明中直接利用生产上用的棉花不育系，进行棉花的花粉漂移试验研究。不育系的棉花是否会影响蜜蜂采蜜的形为。OK.茨同可夫(1953)认为蜜蜂不仅不采集棉花花粉，甚至在离开田野之前要落到植物上，仔韧地把落到茸毛上的花粉从身上清除掉。卡席耶夫(1959)进一步研究表明:蜜蜂在棉花上工作时主要是采取花蜜，只有一小部分蜜蜂在采蜜之后也采集花粉。花粉的大小是影响蜜蜂采粉的主要限制因素，蜜蜂倾向于采集110微米小的棉花花粉，而绝大数棉花品种的花粉直径在120-133微米之间。蜂农的生产实践也发现:蜜蜂对花粉粒大的虫媒花粉也不太喜欢，如:棉花、南瓜。因此，我们认为从采蜜的角度上时，可育棉花与不育棉花没有本质的区别。我们在蜜蜂辅助授粉的的制种试验中也观察到，蜜蜂造访可育父本和不育系母本的频率基本上是一致的。

【发明内容】
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[0009]本发明涉及一种利用棉花不育系进行转基因棉花花粉漂移距离研究的一种方法，目的是确定设立转基因棉花安全的隔离带的距离，同时也可以用来研究不同授粉昆虫在棉花传粉过程中作用。其主要方法是根据不同生态区和研究需要在转基因棉花四周，按一定的距离种植的棉花不育系，，然后田间观测棉花结籽情况来计算传粉比率和基因漂移距离。其方法简单、准确、直观。这是因为棉花是常异交作物，为虫媒花，自然条件下异交率5-10%，在通常的转基因基因漂移的试验中，大部分的种子是自交结种，收籽大，影响了直接观察。不育系在在转粉试验中，只要结籽的，基本是都是异交，这样很容易评价传粉比率，传粉来源。
[0010]本方法的可行性是与常规方法试验比较而获得。试验安排于2012年在新疆石河子大学农验场二连试验站石河子大学试验地。棉花不育系1308A由农七师农业科学研究所提供，带有NPTII筛选记基因的转基因抗病棉花材料种植50亩试验地中央，面积约100m2，其东南西北四个方向按(lm、2.0m、2.5m、5m、10m、25m、50m、100m)不同距离种植棉花不育系1308A品系各10m2。田间管理同常规生产田，棉花吐絮后分别按不同距离收获IOm2不育系棉花上的所有棉籽和随机抽取相邻位置棉铃5株，重复3个区域。棉花不育系结铃率极低，实际不到I %，单铃种子数一般只有3-8个不等，而正常棉花平均结铃5.5个，单铃结籽数达28-35粒。扎花脱绒后，直接播种到育苗盘中，在温室中催芽出苗，子叶展开露出真叶时，按直接喷施浓度度7500PPm卡那霉素溶液。10天后查看真叶显色情况，调查阳性率。结果二者的结果极为相似，在距离转基因棉Im处收获的抗性植株最多，各方向分别平均为1.9和
1.83%左右，而相距2m时，抗性株率分别仅平均为0.45%和5%;相距25~40m时，抗性株率都已降低为O。证明了方法的可靠性。
【专利附图】

【附图说明】:
[0011]图1是试验地种植示意图【具体实施方式】:
[0012]非转基因的棉花不育系的获得可通过具有三系配套的科研和生产单位购买获得。转基因棉花根据转目标基因的不同而不同。
[0013]实施例:
[0014]在具有进行转基因安全性实施条件的试验地，在所设计的试验地的中心位置种植转基因棉花，一般不小于50m2，然后根据不同生态区和研究目的需要，在不同的方向按一定的距离种植不育系棉花，面积不小3m2，棉花按正常的管理方法进行。棉花吐絮后，按不同的位置分别收获棉花不育系上的棉籽。棉籽脱绒处理后，播种到试验地。针对于目标基因不同，采用不同的检测方法。也可以用植物载体上所带的抗性基因不同，选择相应的除草剂或卡那霉素进行检测 ，或可以通过目标基因序列，设计特异性引物，通过PCR的方法对基因漂移频率进行分析，这些所用的技术都是分子生物学的常规技术，在一般的分子生物学实验室就可进行。
【权利要求】
1.选择生产上杂交制种用的棉花不育系作为研究转基因棉花的花粉飘移或基因飘移的一种方法，用于分析花粉漂移距离，确定转基因棉花在不同的生态条件下，转基因棉花种植的安全隔离距离，其主要特征是作为转基因棉花粉飘移的受体棉花是雄性不育，防止棉花自交干扰。
2.根据权利要求1的要 求，棉花的不育系可采用目前生产上使用的任何棉花不育系材料。
【文档编号】A01G1/00GK103891482SQ201210567546
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】祝建波, 李予霞, 王爱英, 冯玉杰, 宋丽娟, 沈海涛, 刘红玲 申请人:石河子大学