专利名称：一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤模型的建立方法，具体地说是一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法。
背景技术：
临床上常见的部分良性肿瘤具有易复发或多发的特性，手术过程中的不慎操作，往往会造成术后肿瘤沿手术切口呈串珠状种植性生长。术后肿瘤的种植性生长及复发给患者的生理和心理上带来极大的创伤和痛苦；多次复发还可能导致肿瘤恶变，尤其是发生于口腔颌面部的某些良性肿瘤，如人涎腺多形性腺瘤，WHO将其定义为临界瘤，由于其发生部位的特殊性，也给再次手术带来困难，严重影响了患者的生存质量。 目前国内外学者对人涎腺多形性腺瘤进行的研究，其研究对象多局限于离体标本，主要是对肿瘤的临床流行病学、病因学、病理学、分子生物学以及手术方式的改进、基因治疗方面的研究与探索。有学者通过将人涎腺多形性腺瘤的组织块移植至裸鼠背部皮下，以试图建立移植瘤动物模型，但所建立的动物模型存在组织块消失和退化的缺点，因而未能在研究中大量应用。也有学者通过转基因技术制备了人多形性腺瘤PLAGl转基因小鼠模型，由于其为转基因技术制备的动物模型，虽然转基因小鼠颌下腺肿瘤模拟了人类多形性腺瘤，但在肿瘤的组织发生上与人多形性腺瘤有较大差异，组织学表现上也存在差异，甚至在肿瘤发生晚期阶段出现恶变倾向。由于目前存在涎腺多形性腺瘤细胞培养困难、活体组织模型建立更加困难的问题，致使肿瘤的组织及形态发生机理、种植或复发机理难以取得突破性进展。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，以解决目前人涎腺多形性腺瘤不能建立活体组织模型的问题，为难以进行活体研究的良性肿瘤研究提供一种活体组织模型。本发明是这样实现的一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，包括以下步骤( I)材料与试剂的制备培养液1:取少量RPM1-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；培养液I1:取少量RPM1-1640培养液，加入5_10ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；培养液II1:取少量RPM1-1640培养液，加入15_20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、O. 25g透明质酸，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；处理液1:取少量RPM1-1640培养液，加入10-15ml胎牛血清、10000U青霉素、5000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补足至IOOml ；处理液I1:取少量RPM1-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、Ig透明质酸，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；选择脱细胞真皮基质、胶原凝胶、胶原海绵或聚乳酸中的一种作为支架材料，所述支架材料以缓冲液清洗2-4次，于所述处理液II中浸泡7-14天后，在0-4°C温度下保存，得到经处理的支架材料；(2)原代培养(2-1)涎腺多形性腺瘤细胞原代培养患者手术取下的涎腺多形性腺瘤肿瘤组织，于所述处理液I中浸泡处理，取肿瘤组织块，清洗2-3次之后，于所述培养液I中切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，培养瓶于CO2培养箱中倒置，使组织块贴附于培养瓶底部，2小时后将培养瓶放正，加入所述培养液I，在CO2培养箱中继续培养，24小时后 更换所述培养液I，此后每隔I天定期更换一次所述培养液I，18-22天后，得到原代培养的肿瘤细胞；(2-2)皮下纤维组织细胞原代培养来自同一患者的正常皮下纤维组织，于所述处理液I中浸泡处理，然后进行清洗，切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，力口入所述培养液II后，于CO2培养箱中培养，24小时后更换所述培养液II，此后每隔3天定期更换一次培养液II，15-19天后，得到原代培养的成纤维细胞；(3)传代培养(3-1)涎腺多形性腺瘤细胞传代培养所得到的原代培养的肿瘤细胞，弃去培养液，以缓冲液清洗2-3次，加消化液进行消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入所述培养液I终止消化，吹打后收集细胞悬液，离心弃上清后，加所述培养液I稀释，然后按1: 3-4的比例分瓶后加入培养液I，置于CO2培养箱中进行培养，每隔I天更换所述培养液I 一次，进行肿瘤细胞传代培养；在传代培养过程中，采用反复贴壁法去除肿瘤细胞中的成纤维细胞；(3-2)成纤维细胞传代培养所得到的原代培养的成纤维细胞，弃去培养液，以缓冲液清洗2-3次，加消化液进行消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入所述培养液II终止消化，吹打后收集细胞悬液，离心弃上清后，加所述培养液II稀释，然后按1: 3-4的比例分瓶后加入所述培养液II，置于CO2培养箱中培养，每隔2天更换所述培养液II 一次，进行成纤维细胞传代培养；( 4 )体外共同培养(4-1)将对数生长期的传代培养的肿瘤细胞制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为I X IO6个/ml，取Iml单细胞悬液，离心后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于经处理的支架材料中央，于CO2培养箱中孵育，I小时后加入所述培养液III进行体外培养,每8小时更换所述培养液III一次，连续进行3-5天体外培养，得到肿瘤细胞支架组织；(4-2)将对数生长期的传代培养的成纤维细胞制成单细胞悬液，调整成纤维细胞浓度为I X IO6个/ml，取O. 5ml单细胞悬液，离心后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于所述肿瘤细胞支架组织中央，加入所述培养液III，在CO2培养箱中进行体外共同培养，每8小时更换所述培养液III一次，连续进行7-10天体外共同培养，得到共同培养的支架组织；(5)移植在对共同培养的支架组织进行组织学鉴定确认后，将共同培养的支架组织作为移植物移植入裸鼠背部皮下，连续饲养3-6个月后，建立组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型。所述CO2培养箱的培养条件是培养温度为37°C，CO2浓度为占空气总量的5%，并在饱和湿度环境下。所述离心的操作条件是离心转速为1200r/min，离心操作时间为5分钟。所述清洗的操作步骤是先用O. OlM PBS缓冲液进行清洗，再用胎牛血清与RPM1-1640培养液的混合液进行清洗；所述混合液中的胎牛血清与RPM1-1640培养液的体积比为1: 5。所述缓冲液为PBS缓冲液、hanV s缓冲液或D-hanV s缓冲液中的一种。本发明的最大特点是运用组织工程学的方法和技术，建立起了人涎腺多形性腺瘤 的活体组织模型，该活体组织模型没有模型中组织块的消失或退化的问题，在肿瘤组织发生上与人多形性腺瘤没有差异，在组织学表现上也没有差异，因此，为人涎腺多形性腺瘤的研究提供一种有用的、可信的和可行的活体组织研究模型，为研究这类肿瘤的发病机制及探讨各种创新治疗方法提供了研究基础，同时也为其他良性肿瘤的活体组织模型的建立，提供了一种可供借鉴的思路。
图1是本发明的流程图。图2是所建立的组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的组织学观察结果。图3是所建立的组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的免疫组织化学染色观察结果。
具体实施例方式参考图1，本发明人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，包括以下步骤( I)材料与试剂的制备培养液I的制备取少量RPM1-1640培养液，加入20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补足至100ml。培养液II的制备取少量RPM1-1640培养液，加入IOml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补足至100ml。培养液III的制备取少量RPM1-1640培养液，加入20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、O. 25g透明质酸，混匀，加RPM1-1640补足至100ml。处理液I的制备取少量RPM1-1640培养液，加入IOml胎牛血清、10000U青霉素、5000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补足至100ml。处理液II的制备取少量RPM1-1640培养液，加入20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、Ig透明质酸，混匀，加RPM1-1640补足至100ml。O. OlM PBS缓冲液的制备称取KH2PO4 · H2OO. 27g,Na2HPO4 · 12H20 2. 85g,NaCl8. 50g,
KClO. 20g,加少量双蒸水溶解后，继续加入双蒸水定容至1000ml，高压灭菌，4°C保存。支架材料的处理脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,缩写为ADM),在生物安全柜内，于无菌条件下将其切割成5X5X2mm3大小，用O. OlM PBS缓冲液浸洗3次后，在4° C温度条件下浸泡于所述处理液II中7-14天。实验动物4周龄、雌性、16-17克的BALB/C_nu裸鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供。
组织来源人涎腺多形性腺瘤肿瘤组织取自外科手术切除的标本，并经两名病理医师诊断为涎腺多形性腺瘤，再取同一患者的正常皮下纤维组织，无菌、0-4°C条件下保存于含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPM1-1640培养液中备用。(2)原代培养(2-1)涎腺多形性腺瘤细胞的原代培养将保存的涎腺多形性腺瘤标本取出，置于处理液I中浸泡15分钟，去除腺瘤标本中的腺体组织、肿瘤包膜、血凝块及坏死组织等，得到所需要的肿瘤组织块，将肿瘤组织块先用O. OlMPBS缓冲液进行清洗，再用胎牛血清与RPM1-1640培养液的混合液(胎牛血清与RPM1-1640培养液的体积比为1: 5)清洗，重复清洗3次后，置于培养液I中，将肿瘤组织块切成适于细胞培养的I X I X Imm3大小的组织块，置于25ml培养瓶的底部，将培养瓶倒置于CO2培养箱中静置2小时(CO2培养箱培养的培养条件是温度为37°C，CO2浓度为占空气总量的5%，并在饱和湿度环境下，下同)，使组织块贴附于培养瓶的底部，然后将培养瓶放正，加入培养液I，在CO2培养箱中继续培养，24小时后更换培养液I 一次，此后每隔I天定期更换培养液I 一次，18-22天后，得到原代培养的肿瘤细胞。在组织块培养7-9天之后，倒置显微镜下观察，可以看到组织块周围长出一小片细胞，称之为“细胞晕”，随肿瘤细胞不断的分裂生长，“细胞晕”的面积逐渐扩大，与相邻的“细胞晕”逐渐融合；培养到18-22天，“细胞晕”融合率可达80-90%，显微镜下观察显示，大部分肿瘤细胞呈多边形或短梭状，小部分肿瘤细胞成长梭状。(2-2)皮下纤维组织细胞的原代培养来自于同一患者的皮下纤维组织，置于处理液I中浸泡15分钟后，先用O. OlMPBS缓冲液进行清洗，再用体积比为1: 5的胎牛血清与RPM1-1640培养液的混合液清洗，重复清洗3次后，切成适于细胞培养的IX Imm2大小的组织块，置于25ml培养瓶中，加入培养液II，于37° C、5%C02、饱和湿度的CO2培养箱中培养，24小时后更换培养液II 一次，此后每隔3天定期更换培养液II 一次，15-19天后，得到原代培养的成纤维细胞。在组织块培养12-14天后，倒置显微镜下观察，可以看到组织块周围细胞游出，细胞胞体较大，成梭形或不规则形；培养至15-19天左右时，“细胞晕”融合率达80-90%，此时细胞细长，排列成放射状或漩涡状。(3)传代培养(3-1)涎腺多形性腺瘤细胞的传代培养用通过步骤(2-1)得到的原代培养的肿瘤细胞，弃去培养液I，以O. OlM PBS缓冲液清洗三次后，加入消化液消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入培养液I终止消化，吹打后收集细胞悬液，于1200r/min条件下离心5分钟，弃上清，加入培养液I进行稀释，然后按1: 3的比例分瓶后，加入培养液I，置于37° C、5%C02、饱和湿度的CO2培养箱中培养，每隔I天更换培养液I 一次，进行肿瘤细胞的传代培养。本步骤所用到的消化液是O. 25%的胰蛋白酶与O. 02%的EDTA的混合液，混合液中的O. 25%的胰蛋白酶和O. 02%的EDTA的体积比为1:1。传代后48小时左右时，细胞开始贴壁生长，此时细胞多数呈多边形，部分短梭状细胞变为圆形或椭圆形。在传代培养过程中，采用反复贴壁法去除肿瘤细胞中混杂的成纤维细胞，其具操作过程如下在肿瘤细胞传代培养过程中，每隔3-6天，倒去旧培养液I后，在更换新的培养液I之前，先将所培养的肿瘤细胞用hank' s缓冲液清洗3次，然后加入消化液(体积比为I I的O. 2%EDTA和O. 25%胰蛋白酶混合液)，37°C条件下消化10分钟。显微镜下检查，可 见成纤维细胞成圆形，肿瘤细胞维持原状，消化完毕后吸出消化液,加hanV s缓冲液吹打细胞，使成纤维细胞脱落后吸出，肿瘤细胞用hanV s缓冲液轻轻漂洗3次，加入新培养液I继续培养。(3-2)成纤维细胞的传代培养用通过步骤(2-2)得到的原代培养的成纤维细胞，弃去培养液II，以O. OlM PB S缓冲液清洗三次后，加入消化液消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入培养液II终止消化，吹打后收集细胞悬液，于1200r/min条件下离心5分钟，弃上清，加入培养液II进行稀释，然后按1: 4的比例分瓶后，加入培养液II，置于37° C、5%C02、饱和湿度的CO2培养箱中培养，每隔2天更换培养液II 一次，进行成纤维细胞的传代培养。本步骤所用到的消化液是O. 25%的胰蛋白酶与O. 02%的EDTA的混合液，混合液中的O. 25%的胰蛋白酶和O. 02%的EDTA的体积比为1:1。传代后24小时左右时，细胞开始贴壁生长，此时细胞多为长梭形，可见线状细胞关起。( 4 )体外共同培养(4-1)传代培养的肿瘤细胞生长至第3-4代时，到达对数生长期。按常规方法将对数生长期的肿瘤细胞制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为I X IO6个/ml，取Iml单细胞悬液于1200r/min条件下离心5分钟，弃上清后，吸取离心管底细胞团块接种于经处理的支架材料中央，置于37° C、5%C02、饱和湿度的CO2培养箱中孵育I小时后，加入培养液III在CO2培养箱中继续培养，每8小时更换培养液III一次，连续进行3天体外培养，得到肿瘤细胞支架组织。(4-2)传代培养的成纤维细胞生长至第3-4代时，到达对数生长期。按常规方法将对数生长期的成纤维细胞制成单细胞悬液，调整成纤维细胞浓度为I X IO6个/ml，取O. 5ml单细胞悬液于1200r/min条件下离心5分钟后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于所述肿瘤细胞支架组织中央，加入培养液III，在CO2培养箱中进行体外共同培养，每8小时更换培养液III一次，连续进行7天的体外共同培养，得到共同培养的支架组织。成纤维细胞在生长过程中，可以分泌多种细胞外基质及生长因子，为肿瘤细胞的生长以及为进而形成的组织块提供营养。(5)在对共同培养的支架组织进行组织学鉴定确认后，在SPF动物室内，将共同培养的支架组织作为移植物移植入裸鼠背部皮下，术后裸鼠继续在SPF条件下饲养3个月，SP建成组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型。(6)移植术后3个月，在动物全麻状态下取出移植物，对所建立的组织模型进行组织学检查及免疫组织化学染色观察，通过观察可见在组织模型的表面有毛细血管生长，移植物由植入前相对松散的组织块变为实性团块，生长的肿瘤呈类圆形，周围可见纤维包膜包绕，组织学显示其具有涎腺多形性腺瘤典型的组织学特征，肿瘤细胞呈梭形、多边形或圆形，HE染色观察，可见双导管结构(图2);免疫组织化学染色观察，可见双导管结构外层细胞S-100蛋白染色阳性(图3)。以上为以人涎腺多形性腺瘤为例给出的组织工程化涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，涎腺多形性腺瘤属于良性肿瘤的一种，由于其具有一般良性肿瘤尤其是临 界瘤所具有的一般特点，因此以上实施例所给出的方法也为其他类型的良性肿瘤的活体组织模型的建立提供了可供借鉴的方法和思路。
权利要求
1.一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其特征是，包括以下步骤(1)材料与试剂的制备培养液1:取少量RPM1-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、IOOOU青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；培养液I1:取少量RPM1-1640培养液，加入5-10ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；培养液II1:取少量RPM1-1640培养液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、O. 25g透明质酸，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；处理液1:取少量RPM1-1640培养液，加入10-15ml胎牛血清、10000U青霉素、5000U链霉素，混匀，加RPM1-1640补足至IOOml ；处理液I1:取少量RPM1-1640培养液，加入15_20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U链霉素、Ig透明质酸，混匀，加RPM1-1640补至IOOml ；选择脱细胞真皮基质、胶原凝胶、胶原海绵或聚乳酸中的一种作为支架材料，所述支架材料以缓冲液清洗2-4次，于所述处理液II中浸泡7-14天后，在0-4°C温度下保存，得到经处理的支架材料；(2)原代培养(2-1)涎腺多形性腺瘤细胞原代培养患者手术取下的涎腺多形性腺瘤肿瘤组织，于所述处理液I中浸泡处理，取肿瘤组织块，清洗2-3次之后，于所述培养液I中切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，培养瓶于CO2培养箱中倒置,使组织块贴附于培养瓶底部，2小时后将培养瓶放正，加入所述培养液I，在CO2培养箱中继续培养，24小时后更换所述培养液I，此后每隔I天定期更换一次所述培养液I，18-22天后，得到原代培养的肿瘤细胞；(2-2)皮下纤维组织细胞原代培养来自同一患者的正常皮下纤维组织，于所述处理液 I中浸泡处理，然后进行清洗，切成适于进行细胞培养的组织块，置于培养瓶底部，加入所述培养液II后，于CO2培养箱中培养，24小时后更换所述培养液II，此后每隔3天定期更换一次培养液II，15-19天后，得到原代培养的成纤维细胞；(3)传代培养(3-1)涎腺多形性腺瘤细胞传代培养所得到的原代培养的肿瘤细胞，弃去培养液， 以缓冲液清洗2-3次，加消化液进行消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入所述培养液I终止消化，吹打后收集细胞悬液，离心弃上清后，加所述培养液I稀释，然后按 I 3-4的比例分瓶后加入培养液I，置于CO2培养箱中进行培养，每隔I天更换所述培养液I 一次，进行肿瘤细胞传代培养；在传代培养过程中，采用反复贴壁法去除肿瘤细胞中的成纤维细胞；(3-2)成纤维细胞传代培养所得到的原代培养的成纤维细胞，弃去培养液，以缓冲液清洗2-3次，加消化液进行消化，倒置显微镜下观察大部分细胞变圆时，加入所述培养液II 终止消化，吹打后收集细胞悬液，离心弃上清后，加所述培养液II稀释，然后按1: 3-4的比例分瓶后加入所述培养液II，置于CO2培养箱中培养，每隔2天更换所述培养液II 一次，进行成纤维细胞传代培养；(4)体外共同培养(4-1)将对数生长期的传代培养的肿瘤细胞制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为 I X IO6个/ml，取Iml单细胞悬液，离心后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于经处理的支架材料中央，于CO2培养箱中孵育，I小时后加入所述培养液III,在CO2培养箱中进行体外培养，每8小时更换所述培养液III一次，连续进行3-5天体外培养，得到肿瘤细胞支架组(4-2)将对数生长期的传代培养的成纤维细胞制成单细胞悬液，调整成纤维细胞浓度为I X IO6个/ml，取O. 5ml单细胞悬液，离心后弃上清，吸取离心管底细胞团块接种于所述肿瘤细胞支架组织中央，加入所述培养液III，在CO2培养箱中进行体外共同培养，每8小时更换所述培养液III一次，连续进行7-10天体外共同培养，得到共同培养的支架组织；(5)移植在对共同培养的支架组织进行组织学鉴定确认后，将共同培养的支架组织作为移植物移植入裸鼠背部皮下，连续饲养3-6个月后，建立组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型。
2.根据权利要求1所述的组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其特征是，所述CO2培养箱的培养条件是培养温度为37°C，在空气中含有5%的CO2,并在饱和湿度环境下。
3.根据权利要求1所述的组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其特征是，所述离心的操作条件是离心转速为1200r/min,离心操作时间为5分钟。
4.根据权利要求1所述的组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法， 其特征是，所述清洗的操作步骤是先用O. OlM PBS缓冲液进行清洗，再用胎牛血清与 RPM1-1640培养液的混合液进行清洗；所述混合液中的胎牛血清与RPM1-1640培养液的体积比为1: 5。
5.根据权利要求1所述的组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其特征是，所述缓冲液为PBS缓冲液、hanV s缓冲液或D-hanV s缓冲液中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种组织工程化人涎腺多形性腺瘤活体组织模型的建立方法，其包括以下步骤取自同一患者的涎腺多形性腺瘤肿瘤组织和正常皮下纤维组织细胞分别经原代培养和传代培养后，于相同的培养液中在支架组织上进行体外共同培养，然后移植于裸鼠背部皮下，以建立肿瘤的活体组织模型。该方法运用组织工程学的方法和技术建立了人涎腺多形性腺瘤活体组织模型，为研究人涎腺多形性腺瘤的发病机制及探讨各种创新治疗方法，提供了研究基础，同时也为其他类型的良性肿瘤的活体组织模型的建立提供了可供借鉴的方法和思路。
文档编号A01K67/027GK103013921SQ201210570059
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者任贵云, 王洁, 董福生, 张艳宁 申请人:河北医科大学口腔医学院