专利名称：一种混合菌株发酵生产茶籽粕饲料的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产茶籽柏的方法，具体涉及一种利用面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)与纳豆芽抱杆菌(Bacillus natto)混合发酵生产茶杆柏饲料的方法。
背景技术：
皂苷的毒性主要表现为溶血性，一般认为，溶血性是其苷元可以与红细胞壁上胆甾醇结合生成不溶于水的复合物沉淀，破坏细胞渗透压，使红细胞发生崩解，进而导致溶血现象。皂苷有无溶血活性与皂苷元有关，活性强弱与糖分子的大小、糖分子之间的连接、糖分子上的取代基等有关，此外还与皂苷的浓度有关。茶皂素的结构如附图1所示，属于三萜类皂苷，由糖体、配基和有机酸组成。从分子结构看，茶皂素是一种非离子表面活性剂。其亲水基团由强电负性的含氧基团组成，这些基团集中在茶皂素的糖体配体，有机酸配体及皂苷配基的连接部位，构成亲水部分。其中配基是由非极性的碳氢环链构成，在水溶液中呈现憎水的倾向，成为亲油的主体，所以茶阜素的结构分为亲水和亲油两部分。Sobolewska等在发表于2010年9月(9卷,3期)《Phytochemistry Review》(植物化学评论)425 474 页的《Saponins as cytotoxicagents:a review》(综述阜苷一细胞毒素)一文中称利用酶解法去除阜苷的糖体配体，会降低皂苷的溶血性。酶水解工业化应用成本较高，如能利用微生物发酵，以降低茶籽柏的毒性，将更有工业化应用前景。茶籽柏的纤维素含量高，作为饲料适口性不好。纳豆芽孢杆菌可产高活性纤维素酶，降解原料中的纤维素；同时，乳酸菌可产一些风味成分，有利于提高产品的适口性。
发明内容
本发明的目的在于提供两种发酵菌株，以及利用该菌株进行固态发酵生产茶籽柏饲料的方法，经发酵后使茶籽柏的溶血作用明显下降，降低了茶籽柏的毒性；降解了茶籽柏中的纤维素，利用面包乳杆菌发酵产生风味物质，提高饲料的适口性；利用纳豆芽孢杆菌发酵，使发酵、干燥后的茶籽柏中存在益生菌。为解决上述问题，本发明采用以下技术方案一种面包乳杆菌菌株,其分类命名为面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum),其保藏编号为CGMCC NO. 6304，保藏日期为2012年6月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。一种纳豆芽孢杆菌菌株，其分类命名为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，其保藏编号为CGMCC NO. 2801，保藏日期为2008年12月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
本发明还公开了所述面包乳杆菌菌株与纳豆芽孢杆菌混合发酵茶籽柏生产茶籽柏饲料的方法，包括以下步骤1、种子培养(I)将所述面包乳杆菌菌株涂布于MRS固体培养基，然后于30 40°C厌氧培养2 3天，挑取单菌落接种到种子培养基A中，继续30 40°C厌氧培养，使菌液的0D_值达到0.8±0. 1，备用。所述种子培养基A成分为蛋白胨lO.Og，牛肉膏lO.Og，酵母抽提物 5. Og,纤维二糖 20. Og,吐温-801ml，柠檬酸三铵 2. 0g, K2HP042. 0g, MgSO4 · 7Η200· 2g，MnSO4 · 2Η200· 05g，蒸馏水 1000ml。(2)将上述的纳豆芽孢杆菌菌株涂布于LB固体培养基，将涂布好的平板30 40°C好氧培养I 2天，挑取单菌落接种到种子培养基B中，继续30 40°C培养12 24小时，使菌液的0D_值达到O. 8，备用。所述的种子培养基B成分为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCllOg,蒸懼水 1000ml。2、茶籽柏中加入适量的含一定量葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的pH5. O的缓冲溶液，混合均匀后灭菌备用，得到茶籽柏发酵原料。3、将步骤I中培养的面包乳杆菌与纳豆芽孢杆菌种子液分别接种于步骤2所述的茶籽柏发酵原料中，接种量均为菌液茶籽柏等于3 10ml 100go接种后的原料于30 40°C好氧发酵24 48小时，再于30 40°C厌氧发酵24 48小时，得发酵的茶籽柏饲料。较佳的，步骤2中所述缓冲溶液为pH5. O磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液中添加了葡萄糖1. 5%(w/w)、半乳糖1. 5%(w/w)和硫酸铵2%(w/w)。本发明的优点是利用面包乳杆菌发酵的茶籽柏溶血作用明显下降，从而弥补了茶籽柏在饲料应用方面的不足，降解了茶籽柏中的纤维素，且面包乳杆菌作为一种乳酸菌，能够产生风味物质，提高饲料的适口性；枯草芽孢杆菌是目前国家批准的19种饲料添加剂益生菌之一，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，即使在加热干燥后纳豆芽孢杆菌仍将以芽孢的形式存在于发酵后的茶籽柏饲料中，能够发挥益生菌的作用。本发明的好氧发酵过程中，纳豆芽孢杆菌能够迅速消耗环境中的游离氧，造成低氧环境，非常有利于后续的厌氧发酵过程中面包乳杆菌的生长繁殖。
图1 :茶皂素结构图
权利要求
1.一种利用纳豆芽孢杆菌与面包乳杆菌混合固态发酵生产茶籽柏饲料的方法，包括以下步骤(1)种子培养将面包乳杆菌菌株和纳豆芽孢杆菌菌株分别培养，作为种子备用；(2)营养物配制往茶籽柏中加入含葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的PH5.O的缓冲溶液，混合均匀后灭菌备用，得到固体茶籽柏发酵原料；(3)好氧发酵将面包乳杆菌与纳豆芽孢杆菌种子接种于(2)中所述发酵原料中，30 40°C好氧发酵24 48小时，得到经好氧发酵的茶籽柏饲料半成品；(4)厌氧发酵将(3)所得的茶籽柏饲料半成品在无氧环境中于30 40°C继续发酵 24 48小时，得到固态发酵的茶籽柏饲料；所述面包乳杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No. 6304，所述纳豆芽孢杆菌菌株的保藏编号为 CGMCC NO. 2801。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(I)中所述种子培养后菌液的0D_值为O.8±0· I。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(2)中所述缓冲溶液中葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的含量分别为1. 5%(w/w)、L 5%(w/w)和 2. 0%(w/w)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(3)中面包乳杆菌和纳豆芽孢杆菌的接种量均为菌液茶籽柏为3 IOml 100go
5.根据权利要求1所述的方法，其中(I)中面包乳杆菌菌株的种子培养基成分为蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. Og,酵母抽提物5. Og,纤维二糖20. Og,吐温-801ml，柠檬酸三铵2. Og, Κ2ΗΡ042· 0g, MgSO4 · 7Η200· 2g, MnSO4 · 2Η200· 05g，蒸馏水 1000ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其中(I)中纳豆芽孢杆菌菌株的种子培养基成分为胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g, NaCllOg,蒸懼水1000ml。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液为pH5.O的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明涉及一种混合菌株固态发酵生产茶籽粕饲料的方法，通过将面包乳杆菌和纳豆芽孢杆菌接种于茶籽粕中并进行好氧发酵与厌氧发酵，从而生产出低毒的饲料；本发明弥补了茶籽粕在饲料应用方面的不足，降解了茶皂素，降低了其溶血性；降解了茶籽粕中的纤维素，利用乳酸菌发酵产生风味物质，提高饲料的适口性；另外，由于纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，即使在加热干燥后该菌仍将以芽孢的形式存在于发酵后的茶籽粕中，因此可发挥益生菌的作用。
文档编号A23K1/14GK103039710SQ201310014799
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者张建华, 尹丽茸, 倪银芸, 左琦, 李双双, 林立 申请人:上海交通大学, 福建天生农业股份有限公司