专利名称：一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法的制作方法
技术领域：
本发明属于南美蟛蜞菊的体外繁殖技术领域，涉及植物叶片的快速产生不定根及再生苗的“两步成苗”的方法。
背景技术：
南美膨蜞菊{Wedeliatrilobata (L.) Hitchc.)是菊科膨蜞菊属{Wedelia、一种常绿地被植物，原产南美洲，因其植被覆盖度高，常年开花，最初作为绿化植物被引入我国。近些年，其生长迅速，在华南地区逃逸成有害杂草。目前对于南美蟛蜞菊的研究，文献报道甚少，其大多数的研究在于其生态种群、花发育及种子繁殖等方面的研究，而在分子水平上的研究较少。运用转基因的方法对南美蟛蜞菊的各种不同形状进行遗传改造，变害为宝，并培养出更多有价值的品种，这将对华南地区的绿化有重要的意义。体外繁殖技术是遗传转化体系的基础，其在培育优良种质和濒危物种的繁殖及利用等方面有重大的意义。目前，对南美蟛蜞菊的体外繁殖的研究，还存在着周期长，诱导率低等缺点，因此建立快速高效的南美蟛蜞菊的体外繁殖体系势在必行，并旨在为分子水平的研究打下基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效的南美蟛蜞菊叶片不定根的诱导及再生植株的培养基配方和方法。本发明是通过以下技术方法实现的，一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法，按照下述步骤进行:
(1)取南美蟛蜞菊长势较好的无病虫害的叶片用蒸馏水冲洗干净，用75%(v/v)乙醇擦拭叶片，再用蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌操作台上；
(2)用70%-75%(v/v)乙醇浸泡Imin，并不断地摇动，后倒掉乙醇，加入0.1%(ν/ν)的升萊(HgCl2)浸泡6-8 min,倒掉升萊,灭菌蒸懼水冲洗3-5次,置于无菌培养皿中；
(3)用剪刀将叶片边缘剪掉，将叶片剪成长Icm左右的长方形，叶背向下接种于不定根诱导的培养基上，并将切口紧贴培养基，每个培养皿接种3-4片叶片，培养皿封口后，置于光照培养箱中进行不定根的诱导，培养温度24°C，光照周期16/8 h，湿度70%。(4) 5-6 d后叶边缘及叶脉开始生长少量的愈伤组织,8-10 d颗粒状的愈伤组织上开始产生不定根，取生长不 定根的紧密的愈伤组织转移到不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导。(5) 5-10 d左右产生丛生芽，10-15 d得到完整的南美蟛蜞菊植株。其中步骤(3)中诱导不定根培养基配方如下:MS + NAA 8-15 mg/L，即IL的MS培养基中含有8-15 mg的NAA ；
其中步骤(4)中不定芽分化培养基配方如下:MS + 6-BA 2-5 mg/L + IAA
0.1-0.5 mg/L+脯氨酸 800-1200 mg/L，即 IL 的 MS 培养基中含有 2-5 mg 的 6-BA, 0.1-0.5mg的IAA和800-1200 mg的脯氨酸。本发明提供的南美蟛蜞菊的体外繁殖的方法，不仅解决了南美蟛蜞菊的不定芽诱导的困难，并且具有以下优点:
先迅速诱导不定根的产生，再通过6-BA，IAA和脯氨酸的配比，诱导丛生芽的产生，迅速产生新的植株。其中MS:MS (Murashige and Skoog)培养基；
NAA:蔡乙酸(1-naphthlcetic acid)；
6-BA:6-节氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)；
IAA:口引哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)。
图1为诱导南美蟛蜞菊不定根及丛生芽效果图，其中:1为南美蟛蜞菊叶片外植体(I天)；2为南美蟛蜞菊愈伤组织(5天)；3.为南美蟛蜞菊外植体快速生根(10天)；4为南美蟛蜞菊成苗(20天)。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行详细描述:
实施例1
取南美蟛蜞菊长势较好的无病虫害的叶片用蒸馏水冲洗干净,用75%(v/v)乙醇擦拭叶片，再用蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌操作台上；用70%(v/v)乙醇浸泡I min，并不断地摇动，后倒掉乙醇，加入0.1%(ν/ν)的升汞(HgCl2)浸泡6 min，倒掉升汞，灭菌蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌培养皿中；用剪刀将叶片边缘剪掉，将叶片剪成长I cm左右的长方形，叶背向下接种于添加NAA 15 mg/L的MS培养基上，并将切口紧贴培养基，每个培养皿接种3-4片叶片，培养皿封口后，置于光照培养箱中进行愈伤组织的诱导。培养温度24°C，光照周期16/8 h，湿度70%;5 d后愈伤组织开始生长，10 d颗粒状的愈伤组织上开始长出不定根，挑选组织致密，具有颗粒状的长有不定根的愈伤组织接种到添加6-BA 5 mg/L + IM 0.5 mg/L+脯氨酸800 mg/L的MS培养基上，8 d诱导出丛生芽，12 d得到完整的南美蟛蜞菊植株。图1为诱导南美蟛蜞菊不定根及丛生芽效果图，其中:1为南美蟛蜞菊叶片外植体(I天)；2为南美蟛蜞菊愈伤组织(5天)；3.为南美蟛蜞菊外植体快速生根(10天)；4为南美蟛蜞菊成苗(20天)。
实施例2 取南美蟛蜞菊长势较好的无病虫害的叶片用蒸馏水冲洗干净,用75%(v/v)乙醇擦拭叶片，再用蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌操作台上；用75%(v/v)乙醇浸泡I min，并不断地摇动，后倒掉乙醇，加入0.1%(ν/ν)的升汞(HgCl2)浸泡8 min，倒掉升汞，灭菌蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌培养皿中；用剪刀将叶片边缘剪掉，将叶片剪成长I cm左右的长方形，叶背向下接种于添加NAA 8 mg/L的MS培养基上，并将切口紧贴培养基，每个培养皿接种3_4片叶片，培养皿封口后，置于光照培养箱中进行愈伤组织的诱导。培养温度24°C，光照周期16/8 h，湿度70%;8 d后愈伤组织开始生长，10 d产生不定根，挑选组织致密，具有颗粒状的并长有不定根的愈伤组织接种到添加6-BA 2 mg/L + IAA 0.1 mg/L+脯氨酸1200 mg/L的MS培养基上，13 d诱导出丛生芽，18 d左右得到完整的南美蟛蜞菊植株。实施例3
取南美蟛蜞菊长势较好的无病虫害的叶片用蒸馏水冲洗干净,用75%(v/v)乙醇擦拭叶片，再用蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌操作台上；用72%(v/v)乙醇浸泡I min，并不断地摇动，后倒掉乙醇，加入0.1%(ν/ν)的升汞(HgCl2)浸泡7 min，倒掉升汞，灭菌蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌培养皿中；用剪刀将叶片边缘剪掉，将叶片剪成长I cm左右的长方形，叶背向下接种于添加 NAA 10 mg/L的MS培养基上，并将切口紧贴培养基，每个培养皿接种3-4片叶片，培养皿封口后，置于光照培养箱中进行愈伤组织的诱导。培养温度24°C，光照周期16/8 h，湿度70%;7 d后愈伤组织开始生长，12 d开始生长不定根，挑选组织致密，具有颗粒状的生长有不定根的愈伤组织接种到添加6-BA 3 mg/L + IAA 0.3 mg/L+脯氨酸1000mg/L的MS培养基上，10 d诱导出丛生芽，15 d左右得到完整的南美蟛蜞菊植株。
权利要求
1.一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)取南美蟛蜞菊长势较好的无病虫害的叶片用蒸馏水冲洗干净，用体积比75%乙醇擦拭叶片，再用蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌操作台上； (2)用体积比70%-75%乙醇浸泡I min，并不断地摇动，后倒掉乙醇，加入体积比0.1%(ν/ν)的升萊HgCl2浸泡6-8 min,倒掉升萊,灭菌蒸懼水冲洗3-5次,置于无菌培养皿中； (3)用剪刀将叶片边缘剪掉，将叶片剪成长Icm左右的长方形，叶背向下接种于不定根诱导的培养基上，并将切口紧贴培养基，每个培养皿接种3-4片叶片，培养皿封口后，置于光照培养箱中进行不定根的诱导，培养温度24°C，光照周期16/8 h，湿度70% ； (4)5-6 d后叶边缘及叶脉开始生长少量的愈伤组织,8-10 d颗粒状的愈伤组织上开始产生不定根，取生长不定根的紧密的愈伤组织转移到不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导； (5)5-10 d左右产生丛生芽，10-15 d得到完整的南美蟛蜞菊植株。
2.根据权利要求1所述的一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法，其特征在于其中步骤(3)中诱导不定根培养基配方为IL的MS培养基中含有8-15mg的NAA。
3.根据权利要求1所述的一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法，其特征在于其中步骤(4)中不定芽分化培养基配方为IL的MS培养基中含有2-5mg的6-BA，0.1-0.5 mg的IAA和800-1200 mg的脯氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法，属于南美蟛蜞菊的体外繁殖技术领域。用叶片作为外植体，接种于添加NAA的培养基上，诱导产生不定根，再转移到添加不同激素的MS培养基上诱导不定芽的产生达到再生植株的形成。利用该方法诱导南美蟛蜞菊不定根及及无菌再生植株，为遗传转化等分子水平研究该植物打下良好的基础。该方法公开的南美蟛蜞菊的体外繁殖方法，其方法简单可行，诱导率高，且诱导周期短。
文档编号A01H4/00GK103081806SQ20131001438
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者祁珊珊, 王莉莉, 戴志聪, 杨冉, 杨淞惠, 黄萍, 杜道林 申请人:江苏大学