专利名称：一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制方法
技术领域：
本发明属于精液冷冻液技术领域，尤其涉及一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制方法。
背景技术：
犬是最早被人类驯化的家畜，目前数量最多的也是犬科动物，是世界上外形差异最大、分布最广和品种最多的家畜。人工授精(Al)对犬业的发展至关重要，而人工授精技术的推广依赖于精液的长期保存。与其他动物(如牛、猪)相比，犬人工授精发展的速度缓慢，其主要原因是精液冷冻技术不过关，精液不能长期保存。
发明内容
针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制方法。本发明实施例是这样实现的，一种昆明狼犬精液冷冻液配方，其组成成分为:三羟甲基氨基甲烷2.4 2.46g、柠檬酸钠1.26 1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0 2.126g、家鸽卵黄20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。进一步，pH在6.5 6.8之间。进一步，每IOOml所述昆明狼犬精液冷冻液配方可加入VB1212ml、复合VB4ml、Vc0.50g。
进一步，复合VB的组分为:每2ml含BfOmg, B22mg, B62mg,烟酰胺30mg。进一步，复合VB的添加量为4mL/100mL、Vc的添加量为0.50g。为进一步改进犬精液冷冻方法，提高冻配受胎率，本发明通过对不同配方的稀释液、添加不同剂量的不同维生素对解冻后精子活力影响的试验，提供了一种优良稀释液，达到提闻冷冻精液精子成活率的目的，为进一步在生广当中提闻冷冻精液的品质提供一定参考。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供了一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制技术，其组成成分为:三羟甲基氨基甲烷2.4 2.46g、柠檬酸钠1.26 1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0 2.126g、卵黄(家鸽)20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。pH在6.5 6.8之间。每IOOml加入VB1212ml、复合Vb (每2ml含B120mg, B22mg, B62mg，烟酰胺 30mg) 4ml, Vc0.50g 更有助于保护精子。
以下结合具体的试验结果对本发明作进一步的说明。I试验材料1.1试验动物:昆明 狼犬5只、体重20 30kg、年龄2 8岁、健康、体况良好。1.2试验试剂:三羟甲基-氨基甲烷、双轻乙基-氨基乙烷磺酸、葡萄糖、乳糖、果糖、柠檬酸、甘油、青链霉素、卵黄、姬姆萨染液、伊红-苯胺黑死活染色液、维生素B12、维生素C、复合维生素B等。1.3试验仪器:电光生物显微镜、细胞计数器、恒温箱、离心机、液氮罐、pH试纸等。1.4试验地点:四川农业大学动物医学院胚胎工程基地、奶牛疾病康复中心。1.5试验动物处理:试验前2周进行犬瘟热、细小病毒疫苗免疫，适应性单笼饲养，主要以犬粮附以少量生肉及牛杂等定时、定量、由固定饲养员常规饲喂，自由饮水，采精后每只犬补食两枚生鸡蛋。2试验方法2.1精液的采集用拇指和食指握住犬阴茎，轻拉包皮，将龟头球握在手掌内并给予适当压力，待阴茎充分勃起，用集精漏斗收集精液。2.2精液品质的常规检查2.2.1精液的气味与色泽的检查:无异味、乳白色或淡乳白色者为正常精液；否则均为不正常。2.2.2精液的pH值检查:取一小滴精液用pH值为5.0 8.4的精密试纸测定。2.2.3精子活力的检查:将精液置于37°C的显微镜下，放大400 600倍镜检，用10级评分法作初步评分。进一步用伊红一苯胺黑死活染色法检测(活精子不着色)。精子活率=呈直线运动精子数/总精子数X 100%。2.2.4精子密度的测定(血细胞计数法):血细胞计数法，在400倍显微镜下目测活力，将精液用生理盐水20倍稀释后用血细胞计数板计算密度。2.2.5顶体完整率:用姬姆萨染色法，滴压制片，在1000倍显微镜下检测(活精子不着色)。精子顶体完整率=顶体完整型精子数/精子总数X 100%。1.4.5精子崎形率的检查:用姬姆萨染色法,每样品做两个涂片。在每片左右_二个不同部位各数100个精子，用血细胞计数器记录下每个部位的畸形精子数；每样品两个涂片的平均畸形精子数，代表此精液样品的畸形精子数。畸形率=(片I左右部畸形总数+片2左右部畸形总数)/400 XlOO %。2.3精液的稀释根据原精子的活力、密度等因素采用一步稀释法对精液进行稀释。稀释前，先将稀释液预热到38°C左右。试验中一般将精液密度保持在1.0X IO8AiL左右，不应过高，这样有利于解冻后精子活力的检测。稀释液现配现用，配好后摇匀，1500r/min离心5min。在大量预备试验的基础上，筛选出效果较好的稀释液1、I1、III，其配方见表I。表I稀释液配方稀释剂配方 mill配方in
三羟甲基氨基甲炼2.450g0.40 2.906g
双羟乙基一一氨基乙烷磺酸(BES)1.50g1.50g
乳糖3.40g
果糖1.250g
葡萄糖2.126g0.60g4.16
柠檬酸钠1.470g1.853
卵黄(EYC)20mL20mL25mL
甘油4mL 4raL4mL
双蒸水加到IOOmLIOOmL
宵霉素(IU/mL)10000010001000
链霉素(mg/mL)50000 I]2.4精液的降温与平衡:把稀释好的精液包上8 16层纱布，转移到4°C的恒温环境中进行降温平衡
3.5 4.0h02.5犬颗粒冻精制作用泡沫塑料改制成炸熏盒，内设两室:一室内上置铜纱网，下盛液氮，并设一盖子，为“熏室”;另一室内可直接盛放液氮，为“炸室”。将平衡后的精液直接滴于炸室内液氮中，滴后静置5 8s,在移入熏室中加盖熏蒸6min,收集装袋,浸入液氮。2.6精液的解冻将试管预热到35°C 40°C，从液氮罐内取出颗粒精液迅速投入试管内，轻轻摇动，待颗粒融化到2/3时，即从水浴中取出，继续摇动使其全部融化。3试验结果3.1不同稀释液类型对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响表2所示，1、I1、III三种稀释液制作的冻精解冻后活率均大于30.00%, I液的冻后平均活率最闻，但I和II液差异不显著(P > 0.05),都与III液差异显著(P < 0.05)；顶体完整率和畸形率I液优于Π、ΙΙΙ液，差异显著(P < 0.05)，II液与III液之间差异不显著(P > 0.05)。表2不同稀释液类型对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响
稀释液类别重复次数精子活率(％)顶体完整率(％) 崎形率(％$
冻前1292.22±0.89a98.15±1.77a3.13±0.lie
I 243.35±0.85b78.25 + 3.22b28.11±0.35b
冻 ________
,、 II1242.28土1.44b66.87±4.12c37.23±1.24a
in*_________—-1II1236.34±1.56c64.33±2.58c36.ll±1.89a
、.---.....1、.，，.、.._*,..A -1_.- ' ,.I I 1-1 ~ .Γ _ ^.,ΠI—、f 1..~*
注:同列内上标字母相同表示差异不显著(P > 0.05)，上标字母相邻表示差异显著(P < 0.05)，上标字母相间表示差异极显著(P < 0.01)(下同)；以下试验均选择组方I为基础方。3.2添加不同剂量的维生素B12对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响表3可知，随着维生素B12量的增加，解冻后精子的活率、精子顶体完整率变化不大，差异均不显著(？>0.05)，畸形率以12!^组和16mL组较低，与其他组差异显著(P
<0.05)。表3添加不同剂量的维生素B12对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响
权利要求
1.一种可长期保存昆明狼犬精液的冷冻液配方，其特征在于，其组成成分为: 三羟甲基氨基甲烷2.4 2.46g、柠檬酸钠1.26 1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0 2.126g、家鸽卵黄20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。
2.如权利要求1所述的昆明狼犬精液冷冻液配方，其特征在于，pH在6.5 6.8之间。
3.如权利要求1所述的昆明狼犬精液冷冻液配方，其特征在于，每IOOml所述昆明狼犬精液冷冻液加入VB1212ml、复合VB4ml、Ve0.50g可更好提高保存效果。
4.如权利要求1所述的昆明狼犬精液冷冻液配方，其特征在于，复合VB的组分为:每2ml 含 B12Om g, B22mg, B62mg,烟酰胺 30mg。
全文摘要
本发明公开了一种可长期保存昆明狼犬精液的冷冻液配方，其组成成分为三羟甲基氨基甲烷2.4～2.46g、柠檬酸钠1.26～1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0～2.126g、家鸽卵黄20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。为进一步改进犬精液冷冻方法，提高冻配受胎率，本发明通过对不同配方的稀释液、添加不同剂量的不同维生素对解冻后精子活力影响的试验，提供了一种优良稀释液，达到提高冷冻精液精子成活率的目的。
文档编号A01N1/02GK103141471SQ201310039878
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者沈留红, 宗小兰, 邓俊良, 左之才, 曹随忠, 余树民, 彭广能, 杨健美, 张传师, 马建山, 欧红萍, 杨庆稳, 王海光, 何桥, 卿佰春, 石锦江, 王英柱, 胡延春, 马哓平, 施飞, 叶刚, 王娅, 钟志军, 任志华, 石先鹏 申请人:四川农业大学