专利名称：耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体为耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法。
背景技术：
耐冬山茶为第三纪的残遗植物种类，因地壳运动，使得青岛耐冬与外界山茶基因交流甚少，从而保留了古老而独具特色的遗传特性。从观赏角度而言，耐冬山茶花色艳丽，花型优美，为青岛市花；同时，其叶茎花亦可入药，用于预防和治疗多种疾病，极具医疗应用前景；不仅如此，耐冬山茶还具有很强的CO2吸收能力，且对H2S等有害气体具有较强的抗性，故亦具有净化空气等环保作用，可谓全身是宝。目前生产上使用的种苗仍是以传统方式培育为主。然而，山茶的生长速度慢，繁殖系数低，靠嫁接、扦插等传统方式培育，完全不能满足市场的需求。而关于山茶属植物的组织培养，国内从20世纪80年代开始就有诸多研究工作，并取得了可喜的进展。采用山茶种子的子叶、幼龄山茶花的茎尖与带芽茎节、成年山茶花的茎尖与带芽茎节等，作为外植体均可获得再生植物。现阶段通过“芽生芽”这种茎段培养的方式得到耐冬山茶的例子已有，而对于耐冬山茶由愈伤组织诱导到不定芽分化的例子却鲜有报道，也未见专利申请。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法的技术方案，采用该方法繁殖系数较高，周期较短，同时也为山茶分子育种奠定基础。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤:
1)采集9月初的耐冬山茶果实，剥去果皮，用洗涤剂搓洗种子，再用自来水搓洗至无泡沫，置于培养瓶中，加入75%酒精进行第一次消毒清洗8-12秒，然后纯净水清洗2-3遍，浙干水分，盖上瓶盖，置于无菌超净台备用；
2)再次使用75%酒精对种子表面消毒25-35秒，接着使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将种子铺在放有过滤纸的平皿里吹干水分，备用；
3)剥去种子的内外种皮,接种于愈伤诱导培养基上,培养温度为25±2°C,光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg 1^2，4-D和1.8-2.2 mg L-1 6-BA,愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2_4%，琼脂0.6-0.8%,灭菌前将PH调至5.7-5.9，120_125°C下灭菌20-25分钟；
4)材料接入愈伤诱导培养基后15-18天后开始启动，待第25-28天的时候诱导出的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，淡黄色，泛着些许绿色、晶莹、剔透，这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上，培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤组织过渡培养基为 MS 基本培养基中加入 0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg Ll-BA ；
5)材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内，培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg じ1NAA + 9-11 mg じ1 6-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6mg じ1 IBA + 9-11 mg L-116-BA ;
6)材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用500-550mgL-1的IBA浸没处理20_25min，然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200 u mol m_2 s—1下诱导生根；诱导生根阶段，采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 gL-1，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤1)中:第一次消毒清洗时间9~10秒。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤2)中:再次使用75%酒精对种子表面消毒28-30秒，接着使用0.1% HgCl2浸泡8-9分钟。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤3)中:光照光强为2600 2800 Lx，光照时间为llh/d ;所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.5mg じ12，4-D和1.9-2.0 mg L-11 6-BA,愈伤诱导培养基中蔗糖含量为3%，琼脂0.7%，灭菌前将PH调至5.8，122°C下灭菌22分钟。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤4)中:光照光强为2600 2800 Lx,光照时间为llh/d ;所述的愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入
0.11-0.13 mg じ1NAA + 2.1 mg L-116-BA。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤5)中:光照光强为2600 2800 Lx,光照时间为llh/d ;所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.5 mgL-11 NAA + 10 mg L-11 6-BA或者MS基本培养基中加入0.5mg じ1IBA +10 mg L W-BA。所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤6)中:材料基部用520-530mg L-11 的IBA浸没处理21_23min ；MV液体培养基的纸桥上在120-150 V- mol ia2 s-1下诱导生根；MV液体培养基加入鹿糖16-18 g L-1。所述的2，4-D，别名:(2，4-ニ氯苯氧基)こ酸，2，4_D酸，2，4_D属于苯氧类物质，是ー种人工合成的植物激素具有与生长素(IAA)相似的生理效应，2，4-D主要用于蔬菜开花期沾花，2，4-D因用量和浓度不同，对同一作物组织有不同的效果，浓度低时可促进坐果和无籽果实的发育，浓度稍高就会引起生长上的畸形；更高浓度可以杀死植物，作除草剂用，能够除去多种双子叶杂草。所述的6-BA，化学名称:6-苄氨基腺嘌呤，别名:6_苄氨基嘌呤、细胞分裂素，
6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，因而被广泛采用，并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，可用于提高茶叶、烟草的质量及产量；蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。所述的NAA，也称a-萘こ酸，是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根増加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。适用于谷类作物，増加分蘖，提高成穗率和千粒重；棉花減少蕾铃脱落，增桃增重，提高质量。果树促开花，防落果、催熟增产。瓜果类蔬菜防止落花，形成小籽果实；促进扦插枝条生根等。萘乙酸在植物组培中很是常用，但组培需要无菌环境，这就需要对萘乙酸所配的溶液进行灭菌，选用的灭菌方法很重要，因为萘乙酸属于激素，若经过高温蒸汽灭菌会失活，所以通常采用过滤除菌。所述的IBA，也叫吲哚丁酸，促进植物主根生长，提高发芽率，成活率，用于促使插条生根。上述耐冬山茶 愈伤组织再生植株的方法，为耐冬山茶大规模无性繁殖提供一种周期较短，繁殖系数较高的方法，也为山茶分子育种奠定基础。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。I)采集9月初的耐冬山茶果实，剥去果皮，用洗洁精搓洗种子，再用自来水搓洗至无泡沫，置于培养瓶中，加入75%酒精进行第一次消毒清洗8-12秒，然后纯净水清洗2-3遍，浙干水分，盖上瓶盖，置于无菌超净台备用；
2)再次使用75%酒精对种子表面消毒25-35秒，接着使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将种子铺在放有过滤纸的平皿里吹干水分，备用；
3)剥去种子的内外种皮,接种于愈伤诱导培养基上,培养温度为25±2°C,光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg 1^2，4-D和1.8-2.2 mg Γ1 6-BA,愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2_4%，琼脂0.6-0.8%,灭菌前将PH调至5.7-5.9，120_125°C下灭菌20-25分钟；
4)材料接入愈伤诱导培养基后15-18天后开始启动，待第25-28天的时候诱导出的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，淡黄色，泛着些许绿色、晶莹、剔透，这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上，培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg L-16-BA，主要作用为中和愈伤诱导阶段2，4-D的后续效应；
5)材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内，培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg T1NAA + 9-11 mg Γ1 6-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6mg L-1IBA + 9-11 mg L_16-BA ；
6)材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用500-550mgL—1的IBA浸没处理20_25min，然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200 μ mol m_2 s—1下诱导生根；诱导生根阶段，采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 g L—1，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化。本发明的主要利用耐冬子叶诱导愈伤组织，在对愈伤组织进行状态调整的基础上，利用特定激素配比的MS培养基进行不定芽分化，最后利用“滤纸桥生根法”解决山茶难以生根的技术难题，从而实现耐冬愈伤组织诱导及植株的再生。本发明所述的两类培养及具体配方如下:
权利要求
1.冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)采集9月初的耐冬山茶果实，剥去果皮，用洗涤剂搓洗种子，再用自来水搓洗至无泡沫，置于培养瓶中，加入75%酒精进行第一次消毒清洗8-12秒，然后纯浄水清洗2-3適，浙干水分，盖上瓶盖，置于无菌超净台备用； 2)再次使用75%酒精对种子表面消毒25-35秒，接着使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将种子铺在放有过滤纸的平皿里吹干水分，备用； 3)剥去种子的内外种皮,接种于愈伤诱导培养基上,培养温度为25±2°C,光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg じ12， 4-D和1.8-2.2 mg じ1 6-BA，愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2_4%，琼脂0.6-0.8%,灭菌前将PH调至5.7-5.9，120_125°C下灭菌20-25分钟； 4)材料接入愈伤诱导培养基后15-18天后开始启动，待第25-28天的时候诱导出的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的ー圈，淡黄色，泛着些许绿色、晶莹、剔透，这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上，培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入0.1-0.15 mg じ1NAA + 2.0-2.2 mg じ16-BA ； 5)材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带ー点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内，培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000 Lx，光照时间为10_12h/d ;所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg じ1NAA + 9-11 mg じ1 6-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6mg じ1 IBA + 9-11 mg じ16-BA ; 6)材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用500-550mgじ1的IBA浸没处理20_25min，然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200 u mol m_2 s—1下诱导生根；诱导生根阶段，采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 gじ1，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化。
2.按权利要求1所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤I)中:第一次消毒清洗时间9-10秒。
3.按权利要求1所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤2)中:再次使用75%酒精对种子表面消毒28-30秒，接着使用0.1% HgCl2浸泡8_9分钟。
4.按权利要求1所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤3)中:光照光强为2600 2800 Lx，光照时间为llh/d ;所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.5 mg じ12，4-D和1.9-2.0 mg じ1 6-BA,愈伤诱导培养基中蔗糖含量为3%，琼脂.0.7%，灭菌前将PH调至5.8，122 °C下灭菌22分钟。
5.按权利要求1所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤4)中:光照光强为2600 2800 Lx，光照时间为llh/d ;所述的愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入 0.1 ト0.13 mg じ1NAA + 2.1 mg じ16-BA。
6.按权利要求1所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤5)中:光照光强为2600 2800 Lx，光照时间为llh/d ;所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.5 mg じ1NAA + 10 mg じ1 6-BA或者MS基本培养基中加入.0.5mg L 1IBA + 10 mg L W-BA。
7.按权利要求1所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤6)中:材料基部用520-530mg じ1的IBA浸没处理21_23min ；MV液体培养基的纸桥上在120-150 V- mol ia 2 s-1下诱导生根；MV液体培养基加入鹿糖16-18 g じ1。
全文摘要
耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，属于生物技术领域。其特征在于包括以下步骤采集9月初的耐冬山茶果实，消毒、清洗；剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基；第25-28天将材料转移至愈伤组织过渡培养基上；待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内；材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用IBA浸没处理，然后转到MV液体培养基的纸桥上诱导生根，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化。上述耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，为耐冬山茶大规模无性繁殖提供一种周期较短，繁殖系数较高的方法，也为山茶分子育种奠定基础。
文档编号A01H4/00GK103081807SQ20131004031
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者李纪元, 范正琪, 李辛雷, 殷恒福, 吴斌 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所