专利名称：一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法
技术领域：
本发明涉及一种植物植物技术，即一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法。
背景技术：
在现有技术中，山荷叶tabuIaris (Hems1.) Engler别名佛爷伞、大叶子、大脖梗子，是虎耳草科山荷叶属多年生草本植物。被《中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)》中定为渐危种，国家三级重点保护植物。《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定为省级一类重点保护植物。其根及全草入药，主治腹泻。叶片大，花洁白，可用于林下地面的绿化。根根茎淀粉、鞣质，可酿酒。茎、叶是优质的猪饲料。嫩茎叶及叶芽味酸甜，可直接生食或蘸酱、腌溃、制罐头、什锦袋菜及榨汁制成饮料等。由于山荷叶在自然条件下不易形成种子，自然更新能力极差，加之灭绝性采挖，导致山荷叶的数量越来越少，在长白山区数量十分稀少，分布区域十分狭窄，仅呈零星分布于吉林通化、柳河、浑江、靖宇和长白县等地。因其种子和分根等常规繁殖难度极大，繁殖系数低，导致开发和利用受到极大限制。目前，通过组织培养技术对山荷叶再生芽苗的研究已有过报道，但多局限在利用器官组织诱导产生愈伤组织，再经愈伤组织再分化、继代增殖和芽苗生根等4步才能完成山荷叶种苗的繁殖。在愈伤组织诱导、愈伤组织再分化和继代增殖过程中，由于激素浓度较高和继代次数的增加会导致再生芽苗遗传性状的变化而失去繁殖意义。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种利于山荷叶根芽丛生芽诱导和生根的快速繁殖的基于根芽的山荷 叶直接再生育苗方法。本发明的技术解决方案是:一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法，其步骤如下:
(I)山荷叶根芽处理后作为外植体备用。(2)山荷叶根芽丛生芽的诱导和生根:基本培养基成份和使用量:450mg.L-1 (NH4)2SO4, 1230 mg.!/1KNO3, 227 mg.L^1MgSO4.7H20, 346 mg.L^1KH2PO4 ；9.2 mg.IZ1FeSO4.7H20,12.5 mg.IZ1Na2.EDTA.2H20 ；6.2 mg.IZ1MnSO4.4H20, 3.5mg.L-1ZnSO4 *7H20,0.30 mg.L-1KI ；0.75 mg.L4 盐酸硫胺素，0.75 mg.L4 盐酸卩比卩多醇，13.0g.L-1肌醇；基本培养基中附加萘乙酸0.02 0.03 mg.L'6-苄氨基嘌呤0.15 mg.L-1、激动素(0.50 0.60 mg.L-1和赤霉素2.20 2.40 mg.I71，添加食用白糖20 g.I71,琼脂条7.8 g.L—1，pH 5.9，温度26±2°C，光照强度1000 lx，光照周期10 h.d—1。优选萘乙酸0.03 mg.L'6-节氨基嘌呤0.15 mg.L'激动素0.60 mg.I71和赤霉素2.40 mg.L'(3)山荷叶种苗的快速繁殖和炼苗移栽。步骤(I)中的处理是指将根芽冲洗干净后，用为75%乙醇涮洗20 S，用含为5.0%的次氯酸钠溶液浸泡8 min，无菌水冲洗10次，再用无菌滤纸吸干表面水分，切除受损的组织。
步骤(3)中所述的炼苗移栽是指按每瓶接种5个根芽，45天为I个培养周期，每个根芽在I个培养周期内平均可再生3 4个芽苗，山荷叶每年8个繁殖周期，满足山荷叶工厂化育苗和规模化栽培的需要。步骤(3)中所述的炼苗移栽是待再生的芽苗生根并长至2.00 cm时，在含有5mg.Γ1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经150倍杀毒矾消毒过的泥炭土、河砂和腐烂松针=3:1:1混合的基质中，保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在20 ± 2) °C，每天自然光照10 h, 5 d后揭膜，成活率达98.0%以上。本发明的优点是:1、本发明以野生植株的根芽为材料，利用组织培养技术，通过诱导根芽直接再生形成丛生芽并同时生根的方式对山荷叶进行了快速繁殖，属一步成苗技术；解决了种子和分根等常规繁殖难度极大，繁殖系数低，以往利用植物组织培养方法步骤复杂和遗传性状可能发生变化等缺点。2、本方法可应用于山荷叶种苗的工厂化繁育，对山荷叶的规模化栽培、开发利用和长白山濒危植物种质资源保护具有极大的实际意义。3、山荷叶根芽直接再生率最高，平均再生率达100%以上；炼苗移栽成活率达98.0%以上。下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
具体实施例方式一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法:
1材料与方法
1.1材料来源及处理 山荷叶根芽采自长白山国家级自然保护区北坡。用自来水将根芽上的泥土冲洗干净后，在超净工作台上用为75%乙醇(体积分数)涮洗20 S，用含为5.0%的次氯酸钠溶液(质量分数)浸泡8 min，无菌水冲洗10次，再用无菌滤纸吸干表面水分，切除受损的组织后作为外植体备用。1.2山荷叶根芽丛生芽的诱导和生根
基本培养基成份和使用量:450 mg.T1(NH4)2SO4j^SO mg.T1KNO3,227mg.L-1MgSO4.7Η20，346 mg.L-1KH2PO4 ；9.2 mg.L-1FeSO4.7Η20，12.5 mg.L-1Na2.EDTA.2Η20 ；6.2 mg.L-1MnSO4.4Η20, 3.5 mg.L-1ZnSO4.7Η20,0.30 mg.L-1KI ；0.75 mg.L-1 盐酸硫胺素(VB1)70.75 mg.L-1盐酸吡哆醇(VB6) ,13.0 g.L-1肌醇。基本培养基中附加萘乙酸NAA (0.03 0.08 mg.171)、6_ 苄氨基嘌呤 6-BA (0.20 0.70 mg.171)、激动素 KT (0.15 0.40 mg.L-1)和赤霉素GA3 (1.00 2.10 mg.L—1)，添加食用白糖20 g.L—1，琼脂条7.8g.L'pH 5.9，温度(26±2) °C，光照强度1000 lx，光照周期10 h.cf1。为提高山荷叶根芽的直接再生和生根速度及再生率和生根率，应用均匀设计法设计试验，选用U12 (124)均匀表，每个处理接种根芽数为10个，重复3次，筛选确定山荷叶根芽直接再生形成丛生芽和生根的萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、激动素和赤霉素最佳浓度配比。根芽培养45 d统计直接再生率和生根率，以同时出现根芽再生和生根的苗为准。计算公式为:再生率=再生的芽数/接种的根芽总数X 100% ;生根率=已生根的再生芽苗数/再生出的芽苗总数X 100%。1.3山荷叶种苗的快速繁殖和炼苗移栽
待根芽再生的芽苗形成5 7个芽苗的丛生芽时，剥离丛生芽上的单芽，再次转接到附加6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、激动素和赤霉素的基本培养基中(优化后的培养基)进行快速繁殖，每瓶3个单芽，统计并计算每瓶增殖倍数和周期。 待再生的芽苗生根并长至2.00 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有5 mg.!/1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经消毒过的泥炭土、河砂和腐烂松针(3:1:1)混合的基质中，用薄膜覆盖以保湿保温，每天保持自然光照并通风换气。2结果与分析
2.1萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、激动素和赤霉素对山荷叶根芽直接再生的影响表I数据经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为7= - 238 - 6281, 一 31.912 +586為+ 131X4，显著性水平a = 0.05，复相关系数7 = 0.9379，剩余标准差S = 6.4600，检验值Z7i = 12.79 >临界值/Vo5，y) = 4.120，回归方程显著。萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、激动素和赤霉素对山荷叶根芽直接再生影响具有显著性。通过计算萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、激动素和赤霉素对根芽直接再生的贡献值和贡献率可知，M = 1080,1/,/1/= 50.6% 'U2 = 280，UjU= 13.1% ;"3 = 623，"3/"= 29.2% -,U1 = 509，V4/"= 23.9%，说明 4 个因素对山荷叶根芽直接再生的贡献顺序为:萘乙酸 > 激动素 > 赤霉素>6-节氨基嘌呤，因萘乙酸和6-节氨基嘌呤与根芽直接再生芽苗率呈负相关，而激动素和赤霉素与根芽直接再生芽苗率呈正相关。由此推测，萘乙酸和6-苄氨基嘌呤质量浓度分别低于0.03 mg.I/1和0.20 mg.L—1，激动素和赤霉素质量浓度分别高于0.40 mg -T1和2.10 mg.Ι^可能芽苗再生率更高。为验证此推测，又以萘乙酸质量浓度为0.03,0.02和0.01 mg吨―1，6-苄氨基嘌呤质量浓度为
0.20,0.15,0.10 和 0.05 mg.Γ1，激动素质量浓度为 0.40,0.45,0.50,0.55,0.60,0.65 和
0.70 mg.171，赤霉素质量浓度为2.10、2.20、2.30、2.40和2.50 mg.Γ1开展7个水平的验证补充试验，重复3次。结果发现，萘乙酸质量浓度为(0.01 0.03 mg -Γ1)、6_苄氨基嘌呤质量浓度为(0.10 0.15 mg -Γ1)、激动素质量浓度为(0.50 0.65 mg吨―1)和赤霉素质量浓度为(2.20 2.40 mg.Γ1)时，山荷叶根芽直接再生率最高，平均再生率达262.1%以上，均高于表I所列12个处理的再生率。表I影响山荷叶根芽直接再生和生根主要因素的U5 (52)均匀设计实验安排及结果O
权利要求
1.一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法，其特征在于步骤如下: (1)山荷叶根芽处理后作为外植体备用； (2)山荷叶根芽丛生芽的诱导和生根:基本培养基成份和使用量:450mg.L-1 (NH4)2SO4, 1230 mg.!/1KNO3, 227 mg.L^1MgSO4.7H20, 346 mg.L^1KH2PO4 ；9.2 mg.IZ1FeSO4.7H20,12.5 mg.IZ1Na2.EDTA.2H20 ；6.2 mg.IZ1MnSO4.4H20, 3.5mg.L-1ZnSO4 *7H20,0.30 mg.L-1KI ；0.75 mg.L4 盐酸硫胺素，0.75 mg.L4 盐酸卩比卩多醇，13.0g.L-1肌醇；基本培养基中附加萘乙酸0.02 0.03 mg.L'6-苄氨基嘌呤0.15 mg.L-1、激动素0.50 0.60 mg.L-1和赤霉素2.20 2.40 mg.L—1，添加食用白糖20 g.L-1，琼脂条 7.8 g.L-1，pH 5.9，温度 26±2°C，光照强度 1000 lx，光照周期 10 h.cf1 ; (3)山荷叶种苗的快速繁殖和炼苗移栽。
2.按照权利要求1所述的一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法，其特征在于步骤(1)中处理是指将根芽冲洗干净后，用为75%乙醇涮洗20S，用含为5.0%的次氯酸钠溶液浸泡8 min，无菌水冲洗10次，再用无菌滤纸吸干表面水分，切除受损的组织。
3.按照权利要求1所述的一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法，其特征在于步骤(3)中所述的炼苗移栽是指按每瓶接种5个根芽，45天为I个培养周期，每个根芽在I个培养周期内平均可再生3 4个芽苗，山荷叶每年8个繁殖周期，满足山荷叶工厂化育苗和规模化栽培的需要。
4.按照权利要求1所述的一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法，其特征在于步骤(3)中所述的炼苗移栽是待再生的芽苗生根并长至2.00 cm时，在含有5 mg.Γ1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼 脂，然后植入经150倍杀毒矾消毒过的泥炭土、河砂和腐烂松针=3:1:1混合的基质中，保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在20±2) °C，每天自然光照10h，5 d后揭膜，成活率达98.0%以上。
5.按照权利要求1所述的一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法，其特征在于步骤(2)中基本培养基中附加萘乙酸0.03 mg.L'6-苄氨基嘌呤0.15 mg.L'激动素0.60mg.L-1 和赤霉素 2.40 mg.I71。
全文摘要
本发明涉及一种植物植物技术，即一种基于根芽的山荷叶直接再生育苗方法。其步骤如下(1)山荷叶根芽处理后作为外植体备用。(2)山荷叶根芽丛生芽的诱导和生根在基本培养基中附加萘乙酸0.02～0.03mg·L-1、6-苄氨基嘌呤0.15mg·L-1、激动素0.50～0.60mg·L-1和赤霉素2.20～2.40mg·L-1。(3)山荷叶种苗的快速繁殖。本发明通过诱导根芽直接再生形成丛生芽并同时生根的方式对山荷叶进行了快速繁殖，可应用于山荷叶种苗的工厂化繁育，对山荷叶的规模化栽培、开发利用；山荷叶根芽直接再生率最高，平均再生率达100%以上；炼苗移栽成活率达98.0%以上。
文档编号A01G31/00GK103109748SQ20131007445
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月10日 优先权日2013年3月10日
发明者顾地周, 顾川岳, 姜云天, 朱俊义, 程广有, 陆爽, 潘雨, 禚玲玲, 张学士, 王秋爽, 付航 申请人:通化师范学院