专利名称：一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法。
背景技术：
在现有技术中，金钱松amabilis (Nelson) Rehd.为松科金钱松属落叶乔木。金钱松是我国珍贵的特产树种，与南洋杉、雪松、金松和北美红杉合称为世界五大公园树种，也是全世界唯一的一种。本种分布于江苏南部、安徽南部、浙江西部、江西北部、福建北部、四川东部、湖南和湖北等地。多生长于低海拔山区或丘陵地带，适宜温凉湿润气候。金钱松是著名的古老残遗植物，被《中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)》定为稀有种，国家二级重点保护植物。被《国家重点保护野生植物名录(第一批)》定为国家二级重点保护植物。最早的化石发现于西伯利亚东部与西部的晚白垩世地层中，古新世至上新世在斯匹次卑尔根群岛、欧洲、亚洲中部、美国西部、中国东北部及日本亦有发现。由于气候的变迁，尤其是更新世的大冰期的来临，使各地的金钱松灭绝。只在我国长江中下游少数地区幸存下来，繁衍至今。因分布零星，个体稀少，结实有明显的间歇性，种子萌发率极低。金钱松木材可供建筑、桥梁、船舶和家具等用；种子可榨油；根皮药用，含二萜类、二萜葡萄糖甙、酚类、鞣质及色素等重要化学成分，具有抗菌消炎、止血等功效，可治顽癣、食积和抑制肝癌细胞活性等症；林业部门已把金钱松列为分布区中山、丘陵的重要造林及园林绿化树种，许多城市和植物园已引种栽培。金钱松通常以种子或插条扦插繁殖为主，但其种子萌发极低；插条扦插繁殖不仅生根率和移栽成活率极低，而且导致野生资源受到灭绝性威胁。因此，大规模人工栽培、开发和利用受到极大限制。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种在试管内诱导茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生资源受灭绝性威胁等问题的基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法。本发明的技术解决方案是:一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其步骤如下:
(1)取金钱松苗主干上的新发嫩茎处理后茎段作为外植体备用；
(2)接种到基本培养基+吲哚乙酸0.02 0.04 mg.Γ1 +萘乙酸0.03 0.06mg.I71 + 6-节氨基嘌呤0.10 0.12 mg.I71 +赤霉素2.70 2.80 mg.I71中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养；基本培养基成分和含量为:110.0 mg.Γ1 (NH4)2SO4,660.0 mg.L-1KNO3, 38.0 mg.L-1CaCl2.2H20,42.0 mg.L-1MgSO4.7H20,85.0 mg.L-1KH2PO4 ；2.7 mg.L-1MnSO4.4H20, 2.4 mg.L-1ZnSO4.7H20, 0.35 mg.IZ1KI，1.2 mg.[1H3BO3 ；4.6mg.L 1FeSO4.7H20,6.3 mg.L 1Na2.EDTA.2H20 ；0.8 mg.L 1 盐酸硫胺素(VB1)，0.3 mg.L 1烟酸,0.3 mg.L—1盐酸批卩多醇(VB6)，1.50 mg.L—1甘氨酸，15.0 g.L—1肌醇。优选基本培养基+吲哚乙酸0.04 mg.L—1 +萘乙酸0.03 mg.L—1 + 6-苄氨基嘌呤0.12 mg.L—1 +赤霉素 2.80 mg.L I。(3)金钱松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。步骤(I)中的处理是指摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇涮洗60 S，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段。步骤(3)中的快速繁殖是指按每瓶接种10个茎段，35天为I个周期，每个茎段在I个培养周期内平均可切割成4 5段，每年有多个周期进行扩繁，满足金钱松工厂化育苗和规模化栽培的需要。步骤(3)中的炼苗和移栽是指当种苗扩繁到一定数量后，选取2.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，小植株成活率可达到93.8%以上。本发明的优点是:1、本发明利用植物组织培养技术，采用金钱松野生实生苗主干上的嫩茎尖为材料，在试管内诱导茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生资源受灭绝性威胁等问题。2、本发明为进一步人工规模化繁殖和栽培金钱松提供优质种苗。3、成苗率达
96.6% ;金钱松小植株的炼苗和移栽成活率可达到93.8%以上。下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
具体实施例方式一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法:
I材料与方法
1.1材料及处理
5月上旬，取金钱松2年生苗主干上的新发嫩茎(2.5 3.5 cm)，摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇(体积分数)涮洗60 s,移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min,无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段作为外植体备用。1.2金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长、植株快速和炼苗栽培
基本培养基成分和含量:110.0 mg.T1(NH4)2SO4^e0.0 mg.L-1KNO3, 38.0mg.L-1CaCl2.2Η20，42.0 mg.L-1MgSO4.7Η20，85.0 mg.L-1KH2PO4 ；2.7 mg.L-1MnSO4.4Η20,2.4 mg.L-1ZnSO4.7Η20, 0.35 mg.IZ1KI，1.2 mg.[1H3BO3 ；4.6 mg.L-1FeSO4.7H20, 6.3mg.L-1Na2.EDTA.2Η20 ；0.8 mg *L_1 盐酸硫胺素(VB1), 0.3 mg *L_1 烟酸,0.3 mg *L_1 盐酸批哆醇(VB6)，1.50 mg七1甘氨酸，15.0 g.L-1肌醇;基本培养基中附加吲哚乙酸IAA (0.07 0.12 mg *L O、蔡乙酸NAA (0.04 0.09 mg *L O、6_节氛基嘿呤6_ΒΑ(0.02 0.07 mg *L和赤霉素GA3 (1.50 2.60 mg.L—1)，琼脂条8.5 g. Λ添加食用白糖10.0 g.L—1，调节pH值至5.7，嫩茎段在光照周期7 hM'光照强度800 Ix和温度(24±2) °C条件下培养。为提高金钱松嫩茎段生根和腋芽 萌发生长的速度及生根率，通过均匀设计法设计实验，选用U12(124)均匀表，每个处理接种10个嫩茎段，重复3次，筛选确定影响金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长的吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素最佳浓度配比。茎段培养35d统计生根率和长度，以均出现茎段生根和腋芽萌发生长的苗为准。生根率=(生根的茎段数/接种的茎段总数)X100%,生长率=(苗总长度-1.0)/1.0X 100%。茎段生根后腋芽萌发生长至2.50 cm时，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留0.50剪下苗干，并将苗干切割成0.5 Cm的茎段，再次将小茎段转接到茎段生根同时腋芽萌发生长培养基中，计算出每个茎段生根同时腋芽萌发生长的增殖倍数和周期。当种苗扩繁到需要数量后，且小植株长至2.00 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在杀毒矾溶液(浓度为5 mg.L-1)中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经杀毒矾(200倍液)消毒过的腐熟草炭土、腐烂松针和珍珠岩(3: 2:1)的基质中，覆盖塑料薄膜(透性好)进行保温保湿，温度控制在(20±2) °C，保持相对湿度在70%，自然光照10 h.(Γ1，温度升高时，适当通风换气。2结果与分析
2.1吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素对金钱松茎段生根的影响数据(表I)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为7=109 - 302X, - 35LT2 +416為，显著性水平σ = 0.05，复相关系数TP= 0.9894，剩余标准差S= 1.6800，检验值6 =123.4 >临界值/Vow， =4.066，回归方程具有显著性，吲哚乙酸、萘乙酸和6-苄氨基嘌呤对茎段的生根影响具有显著性，赤霉素对茎段的生根影响不显著。通过计算吲哚乙酸、萘乙酸和6-苄氨基嘌呤对生根的贡献值和贡献率可知，M = 253,/i/= 24.2% 'U2 = Ml,UJU=32.6% -,U,=亂_ = 57.8%，说明3个因素对金钱松茎段生根的贡献顺序为:6_苄氨基嘌呤 > 萘乙酸〉吲哚乙酸，因6-苄氨基嘌呤与生根率呈正相关，而吲哚乙酸和萘乙酸与生根率呈负相关。由此推测，6-苄氨基嘌呤质量浓度高于0.07 mg -Γ1,吲哚乙酸和萘乙酸质量浓度分别低于0.07 mg.Γ1和0.04 mg.Γ1可能有更高的生根率。为验证此推测，又以 6-苄氨基嘌呤为 0.07,0.08,0.09,0.10,0.11,0.12,0.13,0.14 和 0.15 mg. Λ 吲哚乙酸质量浓度为0.07,0.06,0.05,0.04,0.03,0.02和0.01 mg.Ι^，萘乙酸质量浓度为0.04、0.03,0.02和0.01 mg.L—1开展9个水平的补充试验，重复3次。结果发现，吲哚乙酸质量浓度为(0.02 0.05 mg.L—1)、萘乙酸质量浓度为(0.03 0.06 mg.L—1)和6-苄氨基嘌呤质量浓度为(0.09 0.12 mg.Γ1)时，金钱松嫩茎段生根率最高，平均生根率达99.7%以上。均高于表I所列12个 处理的生根率。表I影响金钱松嫩茎段生根和腋芽生长因素的U12(124)试验设计与结果
权利要求
1.一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤如下: (I)取金钱松苗主干上的新发嫩茎处理后茎段作为外植体备用；(2)接种到基本培养基+吲哚乙酸0.02 0.04 mg.Γ1 +萘乙酸0.03 0.06 mg.Γ1 + 6-苄氨基嘌呤0.10 0.12 mg.Γ1 +赤霉素2.70 2.80 mg.Γ1中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养；基本培养基成分和含量为:110.0 mg.Γ1 (NH4)2SO4,660.0 mg.T1KNO3, 38.0mg.L-1CaCl2.2Η20，42.0 mg.L-1MgSO4.7Η20，85.0 mg.L-1KH2PO4 ；2.7 mg.L-1MnSO4.4Η20,2.4 mg.L-1ZnSO4.7Η20, 0.35 mg.IZ1KI，1.2 mg.[1H3BO3 ；4.6 mg.L-1FeSO4.7H20, 6.3mg.L-1Na2.EDTA.2H20 ；0.8 mg.L-1 盐酸硫胺素(VB1), 0.3 mg.L-1 烟酸,0.3 mg.L-1 盐酸批卩多醇(VB6), 1.50 mg.L—1甘氨酸，15.0 g.L—1肌醇； (3)金钱松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。
2.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤(1)中的处理是指摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇涮洗60S，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段。
3.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤(3)中的快速繁殖是指按每瓶接种10个茎段，35天为I个周期，每个茎段在I个培养周期内平均可切割成4 5段，每年有多个周期进行扩繁，满足金钱松工厂化育苗和规模化栽培的需要。
4.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤(3)中的炼苗和移栽是指当 种苗扩繁到一定数量后，选取2.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，小植株成活率可达到93.8%以上。
5.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤(2)中基本培养基+吲哚乙酸0.04 mg.Γ1 +萘乙酸0.03 mg.Γ1 + 6-苄氨基嘌呤0.12mg.L-1 + 赤霉素 2.80 mg.I71。
全文摘要
本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法。其步骤如下(1)取金钱松苗主干上的新发嫩茎茎段作为外植体；(2)接种到基本培养基＋吲哚乙酸0.02～0.04mg·L-1＋萘乙酸0.03～0.06mg·L-1＋6-苄氨基嘌呤0.10～0.12mg·L-1＋赤霉素2.70～2.80mg·L-1中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养；(3)金钱松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。采用金钱松野生实生苗主干上的嫩茎尖为材料，在试管内诱导茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，为人工规模化繁殖和栽培金钱松提供优质种苗。成苗率达96.6%；成活率可达到93.8%以上。
文档编号A01H4/00GK103109747SQ20131007445
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月10日 优先权日2013年3月10日
发明者朱俊义, 顾地周, 顾川岳, 姜云天, 杨丽娟, 梁宇 申请人:通化师范学院