专利名称：一种海葱组织培养的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术、植物茎尖培养技术，主要是一种海葱组织培养的方法。
背景技术：
海葱(Ornithogalum caudatum),别名虎眼万年青,俗称玻璃球花,葫芦兰等,为百合科、虎眼万年青属植物，多年生球根草本花卉，原产非洲南部，喜阳光，夏季忌阳光直射，亦半阴耐寒，好湿润环境，冬季重霜后叶丛仍保持绿色。海葱未开花时株高约为30 40cm，开花时花茎可达50 60cm高，一般每年4月中旬至5月上旬开花，锥形花序，花有白色、橙色和重瓣种，幽雅、朴素，花期长，是布置自然式园林和岩石园和优良材料，也适用于切花和盆栽观赏。同时，海葱也有一定的要用价值，将其叶子和下面的鳞茎切片或块泡酒，可舒筋活血，用于内服外敷，对于跌打扭伤、肌肉过度疲劳有良好的恢复作用。目前，海葱的繁殖主要通过种子及分球繁殖方式进行，但是种球一般每年8 9月才能够作为种球用来繁殖，而实生苗需要培育3 4年才能开花，种球、种子生产受季节、年限限制严重，同时每年繁殖数量有限，不利用海葱的推广。同时，由于海葱种球长期处于地下，容易受到各种病毒的感染，若利用种球进行无性繁殖，一旦种球感染病毒，便很难通过化学药物根除，更严重降低海葱的观赏价值。植物组织培养技术被认为是目前最高效的植物种苗快繁技术手段，目前，国内外尚未见到利用植物组培技术对海葱进行快速繁殖的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种葱组织培养的方法，解决建立良好的海葱组培再生体系，为海葱种苗生产、新品种创制及品质遗传改良等做好技术支持。本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种海葱组织培养的方法，该方法包括以下几个步骤:1)、外植体的选取及处理:选取海葱地下鳞茎及尚未开放的花穗作为起始材料，将鳞茎剥去外部I 2层鳞片，花穗切成Icm长度，作为组培用外植体；2)、初代培养:在超净工作台上，将经过表面消毒的外植体在转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于初代培养基MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中进行初代培养，培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为 45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ;3)不定芽诱导:初代培养获得的干净、成活材料在无菌工作台上接种于不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0 4.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mo I.τα2.s_1 ；4)不定芽增殖:不定芽增殖:在无菌工作台上，将不定芽诱导培养获得的2 3cm高的不定芽2 3个一丛，利用无菌的解剖刀将不定芽基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.moI.πΓ2 *s_1 ；5)、不定芽生根诱导:从基部将高生长到3 5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ；6)、组培苗驯化及移栽:不定芽基部长出3 5条I 2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养I 2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，栽入基质中，保湿90 %以上培养15d，然后在温室中正常培养。初代培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20 40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8 9g/L，培养基pH分装前调整为5.7 5.8。本发明有益的效果是:1、通过组织培养技术进行海葱种苗快繁，生产不受地区、季节、气候及母株生长年限的限制，便于工厂化育苗，可根据订单进行生产，生产时间及规模可控，为海葱的推广应用提供充足的优质种苗保障。2、繁殖系数达到3 5，生根率100%，移栽成活率100%，达到花卉种苗工厂化育苗生产的要求，目前尚未见关于海葱组织培养的文献报道。3、海葱不定芽诱导采用直接器官发生，无愈组织伤诱导及愈伤分化诱导环节，减少植物组培过程中后代变异的发生，后代种苗遗传背景一致，最大限度保持母本的优良性状。4、有利于结实率低、甚至不结实的优良海葱品种的推广。5、建立良好的组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对海葱进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。本发明所述的一种葱组织培养的方法，步骤如下:1、培养基及培养条件:初代培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20 40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8 9g/L，培养基pH分装前调整为5.7 5.8 ;初代培养基为MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L ;不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0 4.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L ;不定芽增殖培养基为 MS+6-BA0.5 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L ;生根培养基为 MS+IBA0 0.5mg/L 或1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;初代培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mo I.πΓ2.s'2、外植体的处理与消毒:选取海葱地下鳞茎及尚未开放的花穗作为起始材料，将鳞茎剥去外部I 2层鳞片，花穗切成Icm左右长度，处理好的外植体用洗洁精溶液清洗20min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗经洗洁精清洗的外植体材料20 30min，在已经过消毒的超净工作台上将经流水清洗过的外植体转移至无菌锥形瓶中，用75%酒精浸泡60s，期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附在外植体表面气泡，倒出75%酒精，再用0.l%HgCl2溶液浸泡材料8 lOmin，或用有效氯浓度为l%NaC10溶液浸泡材料10 15min，浸泡期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附在外植体表面气泡，倒出0.1ffigCl2溶液或l%NaC10溶液，用无菌水清洗经过消毒处理的外植体4 5次，用无菌水浸泡、备用。3、初代培养:在超净工作台上，将经过表面消毒的外植体在转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于初代培养基MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05
0.2mg/L中进行初代培养，培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mo I^m2-S104、不定芽诱导:初代培养获得的干净、成活材料在无菌工作台上接种于不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0 4.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mo I.πΓ2.s'5、不定芽增殖:在无菌工作台上，将不定芽诱导培养获得的2 3cm高的不定芽2 3个一丛，利用无菌的解剖刀将不定芽基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mo I.m_2.s'6、不定芽生根诱导:从基部将高生长到3 5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0
0.5mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mol.1rT2-S-1,生根率100%。7、组培苗驯化及移栽:不定芽基部长出3 5条I 2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养I 2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，栽入基质中，保湿90%以上培养15d，然后在温室中正常培养，移栽成活率100%。最后，应当指出，以上 实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种海葱组织培养的方法，其特征在于:该方法包括以下几个步骤: 1)、外植体的选取及处理:选取海葱地下鳞茎及尚未开放的花穗作为起始材料，将鳞茎剥去外部I 2层鳞片，花穗切成Icm长度，作为组培用外植体； 2)、初代培养:在超净工作台上，将经过表面消毒的外植体在转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于初代培养基MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中进行初代培养，培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ； 3)不定芽诱导:初代培养获得的干净、成活材料在无菌工作台上接种于不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0 4.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mo I.πΓ2.s_1 ； 4)不定芽增殖:不定芽增殖:在无菌工作台上，将不定芽诱导培养获得的2 3cm高的不定芽2 3个一丛，利用无菌的解剖刀将不定芽基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ； 5)、不定芽生根诱导:从基部将高生长到3 5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽,接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.moI.πΓ2 *s_1 ； 6)、组培苗驯化及移栽:不定芽基部长出3 5条I 2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养I 2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，栽入基质中，保湿90%以上培养15d，然后在温室中正常培养。
2.根据权利要求1所述的海葱组织培养的方法，其特征在于:初代培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导 基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20 40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8 9g/L，培养基pH分装前调整为5.7 5.8。
全文摘要
本发明涉及一种海葱组织培养的方法，包括如下步骤培养基的配制、外植体的选取与消毒、初代培养、不定芽诱导、不定芽增值、不定芽生根诱导、组培苗驯化及移栽。基本培养基选用MS培养基，蔗糖用量为20～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，培养基pH分装前调整为5.7～5.8；初代培养基为MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0～4.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；生根培养基为MS+IBA0～0.5mg/L或1/2MS+IBA0～0.5mg/L。本发明的优点建立的海葱组培快繁技术体系增殖系数3～5，生根率100％，移栽成活率100％，组培苗健壮均匀，适合优良海葱种苗脱毒及规模化生产。
文档编号A01H4/00GK103141388SQ20131007405
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者汪一婷, 陈志 , 牟豪杰, 吕永平, 周迪江, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院