专利名称：一种美人蕉茎尖组织培养的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术、植物茎尖培养技术，主要是一种美人蕉茎尖组织培养的方法。
背景技术：
美人蕉(Canna indica)，别名兰蕉、昙华，为美人蕉科、美人蕉属植物，多年生球根草本花丼，原产于美洲热带和非洲等地。美人蕉株高可达100 180cm,丛生,叶片大、叶片颜色丰富，花大，花色艳丽、颜色多样，花期长，是一种非常优良的园林绿化、景观美化植物。美人蕉叶片可吸收二氧化硫、氯化氢等有害物质，叶片虽易受害，但可重新长出新叶，很快恢复生长，也因此可作为监视有害气体污染指示植物，具有净化空气、保护环境作用。另外，美人蕉还可以用作药物治疗疮疡肿毒、子宫出血、白带、急性黄胆等疾病。现在已有一些城市将美人蕉作为主要绿化植物进行种植，但是由于传统繁殖方式种苗生产速度慢，严重限制了美人蕉大规模的应用。目前，美人蕉的繁殖主要通过种子及块茎分株繁殖方式进行。但是目前市场需求大的品种基本上结实率很低、甚至不结实，种子数量有限，而通过块茎分株方式繁殖受到材料本身状态、生产季节及土地的限制，每年产量远远满足不了市场的需求。同时，由于美人蕉长期繁殖材料长期处地下，容易 受到各种病毒的感染，由于美人蕉多采用无性繁殖，一旦感染便很难通过化学药物根除。已有研究表明，美人蕉主要感染病毒包括美人蕉黄斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒、西红柿不育病毒及美人蕉黄色条纹病毒，严重降低了美人蕉的观赏价值。植物茎尖培养被认为是目前最有效的植物脱毒材料获得手段，目前国内外关于美人蕉不同品种快速繁殖报道极少，且增值效率低，最高仅为1.67，至于美人蕉茎尖培养研究，尚未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种美人蕉茎尖组织培养的方法，解决美人蕉通过茎尖培养建立良好的美人蕉组培再生体系，为美人蕉脱毒培养、新品种培养及遗传改良等做好技术支持。本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种美人蕉茎尖组织培养的方法，该方法包括以下几个步骤:I)、外植体的选取及处理:选取美人蕉地下带有芽的根茎，将根茎表面根切除、附着物洗净，然后将带芽的根茎带基部切成约Icm见方，基部厚度约0.5cm大小，作为组培用外植体。2)、茎尖剥离:无菌环境下，将经过消毒的外植体在解剖镜下，先用低倍镜一层一层剥离芽鳞，然后逐步增大放大倍数，继续剥离芽鳞，最后在40 45倍镜下切下0.2
0.5mm长的茎尖部分，最后切取茎尖的刀必须无菌且没有切过任何植物材料。
3)、美人蕉茎尖培养:将切取的茎尖材料接种在茎尖培养用培养基为MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培养条件为:24 + 2V,暗培养7 10d，然后将材料转移至25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mol.m 2.s、4)、不定芽诱导及增殖:茎尖培养获得的不定芽利用无菌的解剖刀将芽基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导及增殖，不定芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L，培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d,光照强度为 45 60 μ.mol.m 2.s 1O5)、不定芽生根诱导:从基部将高生长到3 5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mo I^m2-S10 6)、组培苗驯化及移栽:不定芽基部长出2 3条I 2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养I 2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，栽入基质中，保湿90 %以上培养15d，然后在温室中正常培养。茎尖培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为25 30g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8 9g/L，培养基pH分装前调整为5.7 5.8 ;茎尖培养用培养基为MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+脯氨酸50 200mg/L ;不定芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L ;生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L 或 1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;茎尖培养环境为:24±2°C，暗培养 7 10d，然后将材料转移至25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ *mol.πΓ2 s—1 ；不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mol.m 2.s、起始外植体的选择及处理，茎尖剥离、茎尖培养、不定芽诱导及增殖培养中CaCl2的应用、移栽前驯化过程及移栽后保湿90%以上培养15d。本发明有益的效果是:1、通过组织培养技术进行美人蕉种苗快繁，生产可以不受地区、季节及气候限制，便于工厂化育苗，可根据订单进行生产，生产时间及规模可控，为美人蕉的推广应用提供充足的优质种苗保障。2、利用茎尖培养技术，可有效获得无对美人蕉生长有严重影响病毒的脱毒植株，提高美人蕉的观赏价值及经济价值。3、繁殖系数达到不低于2.5，达到花卉种苗工厂化育苗生产的要求，目前已有关于美人蕉组织培养的文献中，尚未见美人蕉增殖系数达到2的报道。4、美人蕉不定芽诱导采用直接器官发生，无愈组织伤诱导及愈伤分化诱导环节，减少植物组培过程中后代变异的发生，后代种苗遗传背景一致，最大限度保持母本的优良性状。5、有利于结实率低、甚至不结实的优良美人蕉品种的推广。6、建立良好的组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对美人蕉进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。本发明所述的这种美人蕉茎尖组织培养的方法，该方法包括以下几个步骤:1、培养基及培养条件:茎尖培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为25 3·0g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8 9g/L，培养基pH分装前调整为5.7 5.8 ;茎尖培养用培养基为MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+脯氨酸50 200mg/L ;不定芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L ;生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;茎尖培养环境为:24±2°〇，暗培养7 10(1，然后将材料转移至25±21:，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60μ.mol.πΓ2.s_1 ;不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mol.m_2.s'2、外植体的处理与消毒:选取美人蕉地下带有芽的根茎，将根茎表面根切除、附着物洗净，然后将带芽的根茎带基部切成约Icm见方，基部厚度约0.5cm大小，处理好的外植体用洗洁精溶液清洗20min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗经洗洁精清洗的外植体材料20 30min，在已经过消毒的超净工作台上将流水清洗过的外植体转移至无菌锥形瓶中，用75%酒精浸泡60s，期间不断轻轻晃动锥形瓶，再用0.l%HgCl2溶液浸泡8 lOmin，或用有效氯浓度为l%NaC10溶液浸泡10 15min,浸泡期间不断轻轻晃动锥形瓶,然后用无菌水清洗经过消毒处理的外植体4 5次，用无菌水浸泡、备用。3、美人蕉茎尖剥离:消过毒的超净工作台上，将经过消毒的外植体取出放在有无菌滤纸的接种盘中，在解剖镜下，先用低倍镜一层一层剥离芽鳞，逐步增大放大倍数，最后在40倍镜下切下0.2 0.5mm长的茎尖部分，最后切取茎尖的刀必须没有切过任何植物材料，将剥离茎尖培养到培养基后再从锥形瓶中挑取下一个外植体。4、美人蕉茎尖培养:将切取的茎尖材料接种在茎尖培养用培养基为MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培养条件为:24 + 2V,暗培养7 10d，然后将材料转移至25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mol.πΓ2.s_1,至莖尖长至I 2cm后进行不定芽诱导及增殖。5、不定芽诱导及增殖:茎尖培养获得的不定芽利用无菌的解剖刀将芽基部轻轻造成一些伤口，接种于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导及增殖，不定芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L，培养温度25±2°C，光照时间为12 14h/d,光照强度为 45 60 μ.mol.m 2.s 1O6、不定芽生根诱导:从基部将高生长到3 5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0
0.5mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mol.πΓ2.s'7、组培苗驯化及移栽:不定芽基部长出2 3条I 2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养I 2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，栽入基质中，保湿90%以上培养15d，然后在温室中正常培养，成活率100%。最后，应当指出，以上实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种美人蕉茎尖组织培养的方法，其特征在于:该方法包括以下几个步骤: 1)、外植体的选取及处理:选取美人蕉地下带有芽的根茎，将根茎表面根切除、附着物洗净，然后将带芽的根茎带基部切成Icm见方，基部厚度0.5cm大小，作为组培用外植体； 2)、茎尖剥离:无菌环境下，将经过消毒的外植体在解剖镜下，先用低倍镜一层一层剥离芽鳞，然后逐步增大放大倍数，继续剥离芽鳞，最后在40 45倍镜下切下0.2 0.5mm长的茎尖部分，最后切取茎尖的刀必须无菌且没有切过任何植物材料； 3)、美人蕉茎尖培养:将切取的茎尖材料接种在茎尖培养用培养基为MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培养条件为:24±2 °C，暗培养7 10d，然后将材料转移至25±2°C，光照时间为12 14h/d，光照强度为45 60 μ.mol.m 2.s 1 ； 4)、不定芽诱导及增殖:茎尖培养获得的不定芽利用无菌的解剖刀将芽基部造成伤口，接种于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导及增殖，不定芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L,培养温度 25±2°C，光照时间为 12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mol.πΓ2.s_1 ； 5)、不定芽生根诱导:从基部将高生长到3 5cm的丛生不定芽分开成单个不定芽,接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培养温度25±2°C,光照时间为12 14h/d,光照强度为45 60 μ.mol.πΓ2 *s_1 ； 6)、组培苗驯化及移栽:不定芽基部长出2 3条I 2cm的不定根后，将组培移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养I 2d，完成组培苗移栽前驯化，然后将组培苗从培养瓶取出，洗净组培苗表面琼脂，栽入基质中，保湿90%以上培养15d，然后在温室中正常培养。
2.根据权利要求1所述的美人蕉茎尖组织培养的方法，其特征在于:茎尖培养、不定芽诱导及增殖、不定芽生根 诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为25 30g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8 9g/L，培养基pH分装前调整为5.7 5.8。
全文摘要
本发明涉及一种美人蕉茎尖组织培养的方法，包括如下步骤培养基的配制、外植体的选取与消毒、茎尖剥离、茎尖培养、不定芽诱导及增值、不定芽生根诱导、组培苗驯化及移栽。基本培养基选用MS培养基，蔗糖25～30g/L，琼脂粉8～9g/L，培养基pH5.7～5.8；茎尖培养用培养基为MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+L-脯氨酸50～200mg/L；不定芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA2.0～6.0mg/L+CaCl250～800mg/L；生根培养基为MS+IBA0～0.5mg/L或1/2MS+IBA0～0.5mg/L。本发明的优点建立的美人蕉组培快繁技术体系种苗繁殖速度快，健壮均匀，移栽成活率高，适合优良美人蕉种苗脱毒及规模化生产。
文档编号A01H4/00GK103141389SQ20131007407
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者陈志 , 汪一婷, 牟豪杰, 吕永平, 周迪江, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院