专利名称：马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法的制作方法
技术领域：
本发明涉及马铃薯种质资源的保存方法，特别是一种马铃薯脱毒薯苗无菌 循环种质保存法。
技术背景马铃薯是中国乃至世界上第四大作物，其安全生产关系到社会的稳定，而 种质资源是农业生产的基础。马铃薯是无性繁殖作物，其种植过程中易感染病 毒并在来年的种植中传递下去，导致种性退化。茎尖组织培养能有效地脱毒， 防止种性退化，所以保存脱毒马铃薯营养体就是对马铃薯种质资源的保存。在 试管苗的长期保存中，随着继代次数的增加和延长，试管苗出现徒长、径细弱、 节间长、叶片小等问题。目前为克服上述问题，探讨马铃薯种质资源的保存方式主要有(l)在液氮中超低温保存。发表于《甘肃农业科技》2006年第10期的 "马铃薯茎尖超低温保存研究" 一文报道组织培养的茎段经处理后，放入液氮 中保存，再恢复培养，成活率可达42.8%。 (2)用化学试剂处理组培苗，延缓其 生长以达保存的目的。发表于《农村科技》2006年第7期的"马铃薯试管苗保 存技术" 一文报道了培养基中加生长延缓剂B9，可延缓组培苗生长，保存期达 145天，延长了继代培养的间隔时间。发表于《湖南农业大学学报自然科学版》 2005年第5期的"植物生长调节剂对马铃薯试管苗生长和保存的影响" 一文报 道，培养基中加4.80mg/L的多效唑PP333,试管苗保存的时间最长可达300天。 另，发表于《山西农业大学学报自然科学版》2003年第2期的"縮节胺在马铃 薯脱毒试管苗保存中的作用" 一文也报道了縮节胺对马铃薯试管苗有一定的保 存作用。以上两种保存方式的不足之处是第一种保存法需液氮贮存装置，不 便推广应用。而第二种保存法一直需要光照，且继代时间短要不断转接。马铃薯茎尖脱毒组织培养技术和脱毒试管微型薯的诱导方法已为公知的成 熟技术。试管微型薯成熟后，本身固有一定时期的休眠特性。发明内容本发明的目的是提出一种马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，它在现有 成熟的马铃薯茎尖脱毒组织培养技术和脱毒试管微型薯诱导方法的基础上，采 用试管微型薯和试管苗在无菌环境下循环保存，以达到用简易设备，较之一般 组织培养不需添加额外试剂的前提下，省时、省工地保存马铃薯种质资源，促
进马铃薯种植业健康、持续发展。 本发明是这样实现的一种马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，用现有的茎尖组织培养技术获 得脱毒苗，经诱导得到试管微型薯，其特征在于该试管微型薯转入培养瓶中于3 5。C的低温保存200 360天后取出，在温度为20-25°C、光照为2000~4000 勒克斯的条件下培养40~60天得到无菌苗，无菌苗在温度为18 2(TC条件下培养 60-80天后得微型薯，重复上述操作，形成脱毒薯苗循环种质保存。所述的微型薯转入培养瓶前，对培养瓶按如下要求进行灭菌剪1. 0~2. 0 cm 厚、大小相当的海绵垫于培养瓶底，盖上瓶盖，放于1. lkg/cm2的压力下灭菌 30~40分钟。在无菌操作室将微型薯转入经无菌处理的培养瓶中，每瓶装5 10 个试管微型薯。装有微型薯的培养瓶低温保存取出后，向瓶内注入20~40mL已灭菌的MS液 体培养基后，在上述温度、光照条件下得到无菌苗。在无菌操作室内，把20-40mL灭好菌的含有8%蔗糖的MS液体培养基注入装 有试管无菌苗的培养瓶中，然后将培养物放到温度为18-20°C、黑暗的培养室中 培养60-80天后诱导得微型薯。本发明与现有技术相比具有如下优点1、 不需复杂的设备。整个过程所需设备灭菌锅、超净工作台及冰箱等为一 般组培养室具备。2、 不添加生长调节剂，利于有机食品的生产。此保存方法充分利用马铃薯 块茎本身所固有的休眠特性，在低温条件下保存，因此不需添加任何额外化学 试剂，符合生态环保的要求。3、 低温保存后的微型薯成活率高，且整个过程均为无菌操作，不会因培养 物消毒不当造成污染，所以不易造成种质资源丧失。4、 保存周期长、操作简单、省时、省工。微型薯在3 5"C的冰箱可保存6~12 个月，培养试管苗需40~60天，诱导结薯要60 80天，累计保存一个周期长达 480多天，而其间只用采收微型薯一次、加MS液体培养基一次，以及加含8% 蔗糖的MS液体培养基一次，操作简单、省时、省工。
具体实施方式
实施例11) 、用公知技术对薯苗的转心乌品种进行茎尖脱毒培养，并得到脱毒试管 微型薯。2) 、剪l.O cm厚、大小相当的10块海绵垫于10个组织培养瓶底，盖上瓶
盖，把培养瓶放于l.lkg/ci^的压力下灭菌30分钟。3) 、在无菌操作室将无菌试管微型薯转入操作步骤2)所得的无菌瓶中，每 个瓶内装5个试管微型薯。) 、微型薯无菌低温保存将操作步骤3)所得的装有微型薯的培养瓶存放 于3'C的冰箱。5) 、由微型薯生成试管苗200天后，把装有试管微型薯的培养瓶从冰箱取 出，在无菌操作室内向每个瓶内注入20mL己灭好菌的MS液体培养基，然后把 所有装有试管微型薯的培养瓶放于温度为20~22°C、光照为20001x的组织室内 培养40天后，获得无菌苗；统计成苗率可达成98%。6) 、诱导结薯在无菌操作室内，向每个装有试管苗的培养瓶中注入20mL 灭好菌的含有8%蔗糖的MS液体培养基，然后将培养物放到温度为18°C、黑暗 的培养室中培养，诱导结薯；第60天收获试管微型薯，平均每株可结薯3个， 平均薯重为0. 35g。实施例2:1) 、用公知技术对薯苗大西洋品种进行茎尖脱毒培养，并得到脱毒试管微 型薯。2) 、剪2.0 cm厚、大小相当的10块海绵垫于10个组织培养瓶底，盖上瓶 盖，把培养瓶放于1. lkg/cn^的压力下灭菌40分钟。3) 、在无菌操作室将无菌试管微型薯转入操作步骤2)所得的无菌瓶中，每 个瓶内装10个。4) 、微型薯无菌低温保存将装操作步骤3)所得的装有微型薯的培养瓶存 放于4'C的冰箱。5) 、由微型薯生成试管苗360天后，把所有装有试管微型薯的培养瓶从冰 箱取出，在无菌操作室内向每个瓶内注入40mL已灭好菌的MS液体培养基。然 后把装有试管微型薯的培养瓶放于温度为25°C、光照为40001x的组织室内培养 60天后，获得无菌苗；成苗率可达成95%。6) 、诱导结薯在无菌操作室内，向每个装有试管苗的培养瓶中注入40mL 灭好菌的含有8%蔗糖的MS液体培养基，然后将培养物放到温度为20°C、黑暗 的培养室中培养，诱导结薯；第80天收获试管微型薯，平均每株可结薯5个， 平均薯重为0. 24g。实施例3:1)、用公知技术对薯苗合作88品种进行茎尖脱毒培养，并得到脱毒试管微 型薯。 2) 、剪1.5 ciii厚、大小相当的10块海绵垫于10个组织培养瓶底，盖上瓶 盖，把培养瓶放于1. lkg/cW的压力下灭菌30分钟。3) 、在无菌操作室将无菌试管微型薯转入操作步骤2)所得的无菌瓶中，每 个瓶内装8个。4) 、微型薯无菌低温保存将装操作步骤3)所得的装有微型薯的培养瓶存 放于5"C的冰箱。5) 、由微型薯生成试管苗250天后，把装有试管微型薯的培养瓶从冰箱取 出，在无菌操作室内向每个瓶内注入30mL已灭好菌的MS液体培养基。然后把 所有装有试管微型薯的培养瓶放于温度为2(TC、光照为30001x的组织室内培养 50天后，获得无菌苗。成苗率可达成96%。6) 、诱导结薯上述条件下培养获得的无菌苗，在无菌操作室内，向每个 装有试管苗的培养瓶中注入30mL灭好菌的含有8%蔗糖的MS液体培养基，然后 将培养物放到温度为2(TC、黑暗的培养室中诱导结薯。第70天收获试管微型薯， 平均每株可结薯6个，平均薯重为0.22g。
权利要求
1、一种马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，用常规的茎尖组织培养技术获得脱毒苗，经诱导得到试管微型薯，其特征在于该试管微型薯转入培养瓶中于3～5℃的低温保存200～360天后取出，在温度为20～25℃、光照为2000～4000勒克斯的条件下培养40～60天得到无菌苗，无菌苗在温度为18～20℃条件下培养60-80天后得微型薯，重复上述操作，形成脱毒薯苗循环种质保存。
2、 根据权利要求1所述的马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，其特征 在于微型薯转入培养瓶前，对培养瓶按如下要求进行灭菌剪1.0 2.0cm厚、 大小相当的海绵垫于培养瓶底，盖上瓶盖，放于1.1kg/ci^的压力下灭菌30 40 分钟。
3、 根据权利要求1或2所述的马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，其 特征在于将微型薯转入经处理的培养瓶中，每瓶装5~10个试管微型薯。
4、 根据权利要求1所述的马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，其特征 在于装有微型薯的培养瓶低温保存取出后，向瓶内注入20 40rnL已灭菌的 MS液体培养基后得到无菌苗。
5、 根据权利要求1所述的马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，其特征 在于在无菌操作室内，把20-40mL灭好菌的含有8M蔗糖的MS液体培养基 注入装有试管无菌苗的培养瓶中，然后将培养物放到温度为18-20°C、黑暗的 培养室中培养60-80天后诱导得微型薯。
全文摘要
一种马铃薯脱毒薯苗无菌循环种质保存法，用现有的茎尖组织培养技术获得脱毒苗，经诱导得到试管微型薯，其特征在于该试管微型薯转入培养瓶中于3～5℃的低温保存200～360天后取出，在温度为20～25℃、光照为2000～4000勒克斯的条件下培养40～60天得到无菌苗，无菌苗在温度为18～20℃条件下培养60-80天后得微型薯，重复上述操作，形成脱毒薯苗循环种质保存；本发明采用试管微型薯和试管苗在无菌环境下循环保存，以达到用简易设备，较之一般组织培养不需添加额外试剂的前提下，省时、省工地保存马铃薯种质资源，促进马铃薯种植业健康、持续发展。
文档编号A01H4/00GK101147468SQ20071006636
公开日2008年3月26日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者琼 王, 蒋从莲, 郭华春, 龙雯虹 申请人:云南农业大学