专利名称：：一种东方百合组织培养脱毒的方法
技术领域：
：本发明属于植物栽培
技术领域：
，具体涉及一种东方百合组织培养脱毒的方法。
背景技术：
：东方百合"/7/咖spp,cv.orientalhybrids)是百合属中的一个杂交品系，是国际巿场上最受欢迎的球根花卉之一。由于巿场的巨大需求，我国每年要从国外大量进口东方百合开花球和种植母本，仅以2006年为例，进口开花球约'7000万头、种植母本约800万头。不仅耗费大量外汇，而且增加了企业的经营成本和风险。'目前，东方百合种苗的人工培育均釆用常规的植物组织培养方法，即以鳞片为外植体，先诱导愈伤组织，转接后使愈伤组织分化出根和茎，进而培养成瓶苗。但如果外植体带病毒，则该方法只能降低种苗的病毒含量，难以使种苗彻底脱除病毒。病毒会在鳞茎逐年种植中积累，造成种球品质和优良性状的退化。同时，瓶苗移栽后还必须经过练苗过程，以使幼苗缓慢适应移栽环境。此时幼苗的成活率主要取决于练苗设施的好坏和管理者的精细程度，不仅生产周期过长，而且增加了生产管理的成本。根据报道，目前有12种病毒能够危害东方百合生长，其中百合花叶病毒(LiMV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)是危害最严重的病毒，如果脱掉这三种病毒，便可以基本保证百合的品质。目前国内外有关百合的脱毒处理都是单独采用茎尖、药物或热处理方法，这些方法效率低，脱毒效果差，大多脱毒率在30%以下。近年来有采取株芽用热水('50土1)。C处理40分钟后，切取茎尖的方法，虽获得了一定的效果，但组织培养球在5(TC的高温下处理40分钟后，其成活率较低；同时由于珠芽未经消毒，经热处理和切除茎尖后，也难以保证不受污染。迄今为止，现有技术中尚未见能有效克服上述问题的方法报道。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种成本低廉，效果显著的东方百合组织培养脱毒方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。一种东方百合组织培养脱毒的方法，该方法采用以下步骤1、在生长后期选择生长健壮的东方百合植株，取出鳞茎，从鳞茎上分下鳞片，并用清水清洗、消毒后，在无菌条件下，将鳞片分切为3~5块，将切好的鳞片置于发生培养基上进行无菌培养，设定培养温度为22°C~25。C、光照强度为10001x40001x,培养60天后诱导出不定芽；2、将不定芽转接到生长培养基上，在人工气候培养箱中变温培养30天，所述的变温培养条件为每天在温度为37°C、光照强度为10001x40001x的条件下培养12小时，在温度为22'C、黑暗环境下培养12小时，两者交替进行；3、经过30天变温处理后，在无菌条件下，切取0.8~1.Omm茎尖移植到生长培养基中继续变温培养，培养条件为光照/黑暗各12小时交替进行，光照时，培养温度为22。C~25°C、光照强度为10001x40001x;黑暗时，温度为22°C~25°C;培养30~60天后，便可得到所需的无毒株系。所述的发生培养基为含萘乙酸(NAA)0.05-0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含琼脂0.65%的MS高盐培养基或1/2MS高盐培养基。所述的生长培养基为含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含琼脂0.65%的1/2~1/5MS高盐培养基。与现有技术相比，本发明具有如下优点l.通过在变温处理条件下保证组织培养球的生长，同时钝化病毒，减少病毒转移到茎尖，保证生长点不带毒，然后切取0.8-1.Omm茎尖培养，来到达脱毒的目的。2.脱毒效果显著，效率高，一般品种可达到90/。~100%。具体实施方式为了更好地理解本发明的实质，下面结合实施例和实验例对本发明作进一步说明，但它们不是对本发明的限制。实施例1在9月份选择生长健壮的东方百合植株，取出鳞茎，从鳞茎上分下鳞片，并用清水清洗、消毒后，在无菌条件下，将鳞片分切成3~5小快，将切好的鳞片置于发生培养基上进行无菌培养，设定培养温度为23.5°C、光照强度为2000~30001x,培养60天后诱导出不定芽；将不定芽转接到生长培养基上，在人工气候培养箱中变温培养30天，所述的变温培养为每天分别在温度为37°C、光照强度^00-30001x下培养12小时，在温度为22。C、黑暗环境下培养U小时，两者交替进行；经过30天变温处理后，在无菌条件下，切取0.8mm茎尖，移植到生长培养基中继续变温培养30-60天，便可得到所需的无毒株系。培养条件为光照/黑暗各12小时交替进行，光照时，培养温度为22°C~25°C、光照强度为10001x~40001x;黑暗时，温度为22°C~25。C。其中所述的发生培养基为含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含琼脂0.65%的MS高盐培养基或1/2MS高盐培养基。所述的生长培养基为含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含琼脂0.65%的1/2~1/5MS高盐培养基。所述的MS高盐培养基配方见附表1表lMS高盐培养基配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2重复实施例l，有以下不同点分切好的鳞片置于22匸条件下培养。实施例3重复实施例l,有以下不同点分切好的鳞片置于25匸条件下培养。实施例4重复实施例1，有以下不同点分切好的鳞片置于光照强度1000~20001x条件下培养。实施例5重复实施例1,有以下不同点分切好的鳞片置于光照强度3000~40001x条件下培养。实施例6重复实施例l,有以下不同点将不定芽转接到生长培养基上，在人工气候培养箱中变温培养30天，所述的变温培养条件为每天在温度为37°C、光照强度为10001x20001x的条件下培养12小时；在温度为22°C、黑暗环境下培养12小时，两者交替进行。实施例7重复实施例l,有以下不同点将不定芽转接到生长培养基上，在人工气候培养箱中变温培养30天，所述的变温培养条件为每天在温度为37°C、光照强度为30001x40001x的条件下培养12小时；在温度为22°C、黑暗环境下培养12小时，两者交替进行。实施例8重复实施例l，有以下不同点不定芽经过30天变温处理后，在无菌条件下，切取l.Omm茎尖，移植到生长培养基中变温培养。实施例9重复实施例l,有以下不同点不定芽经过30天变温处理后，在无菌条件下，切取0.9mm茎尖，移植到生长培养基中变温培养。实验例(l)材料供实品种为索尔邦(Sorbone),帝拨(Tiber)和西北利亚(Siberia)三个品种，经血清和分子检测分别带有百合花叶病毒(LiMV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的种球。(2)方法按实施例1所述方法将带毒的种球，通过鳞片培养，获得带毒的组织培养苗，将带毒的培养球转移到新的培养瓶中，每瓶5粒，每种病毒转接种5瓶，其中1瓶作为对照放置在22'C12小时光照/12小时黑暗中培养。其余4瓶放置在人工气候箱中培养30天，培养期间，设定温度变化为37°C、光照培养12小时，22'C、黑暗培养12小时，培养1月后，在无菌条件下切取0.8~1.Oinm茎尖进行培养，培养2月后进行病毒检测。(3)结果表l:脱毒处理后脱毒率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果表明，组织培养球经变温处理30天后，切取O.81.0mra茎尖培养的脱毒效果最好，百合花叶病毒(LiMV)、百合无症病毒(LSV)脱毒率达100%,黄瓜花叶病毒(CMV)脱毒率达90%以上。权利要求1、一种东方百合组织培养脱毒的方法，该方法采用以下步骤(1)在生长后期选择生长健壮的东方百合植株，取出鳞茎，从鳞茎上分下鳞片，并用清水清洗、消毒后，在无菌条件下，将鳞片分切为3～5块，将切好的鳞片置于发生培养基上进行无菌培养，设定培养温度为22℃～25℃、光照强度为1000lx～4000lx，培养60天后诱导出不定芽；(2)将不定芽转接到生长培养基上，在人工气候培养箱中变温培养30天，所述的变温培养条件为每天在温度为37℃、光照强度为1000lx～4000lx的条件下培养12小时，在温度为22℃、黑暗环境下培养12小时，两者交替进行；(3)经过30天变温处理后，在无菌条件下，切取0.8～1.0mm茎尖移植到生长培养基中继续变温培养，培养条件为光照/黑暗各12小时交替进行，光照时，培养温度为22℃～25℃、光照强度为1000lx～4000lx；黑暗时，温度为22℃～25℃；培养30～60天后，便可得到所需的无毒株系。2、根据权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于所述的发生培养基为含萘乙酸(NAA)0.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含琼脂0.65。/。的MS高盐培养基或1/2MS高盐培养基。3、根据权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于所述的生长培养基为含萘乙酸(NAA)O.05~0.lmg/L、含蔗糖7%~9%、含琼脂0.65%的1/2-1/5MS高盐培养基。全文摘要本发明公开了一种东方百合组织培养脱毒的方法，选择健康的百合鳞片分切后诱导出不定芽，将不定芽转接到生长培养基上，变温培养30天后，切取茎尖移植到生长培养基中继续变温培养30～60天后，便可得到所需的无毒株系。本发明脱毒效果显著，效率高，一般品种可达到90％～100％。其操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。文档编号A01H4/00GK101156552SQ200710066339公开日2008年4月9日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者丁元明,捷和,和莲彩,寸东义,杨红梅,劲熊,熊灿坤申请人:云南格桑花卉有限责任公司