专利名称：一种野生百合的组织培养方法
技术领域：
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种野生百合的组织培养方法。
背景技术：
植物组织培养技术已广泛应用于各个研究领域，渗透到育种学、遗传学、分子生物学等学科中，成为生命科学中重要的研究技术和手段。组培狭义指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。百合(Lily)是百合科百合(Lilium L.)属多年生球根花卉，在世界观赏花卉生产 中占有重要地位，随着市场需求量的不断增加，人们对百合花的品种质量要求也越来越高，为进一步丰富和改善百合品种及观赏价值，开发野生百合资源，提高百合的组培价值及商品价值，人们对百合野生品种资源、野生百合的组培繁殖以及试管苗生长发育做了大量研究，从依靠鳞片扦插由子球培育成母球的传统的百合种球生产到百合组培快繁。由于百合地下鳞茎数量多，易于获得，取材不受季节限制而成为目前百合组培最主要的外植体材料，但鳞茎生长于地下，带菌多，使得组培消毒过程中难度加大。目前百合组培苗的获得均采用常规的组织培养方法，即将野生百合鳞片用肥皂水刷洗干净，70%酒精消毒30min，然后在饱合漂白水溶液中表面消毒20min，用无菌水冲洗干净，无菌滤纸吸去鳞片表面水分，将外植体切成O. 5cm边长的正方形小块，分别接种到附加不同浓度激素的培养基上，先诱导出愈伤组织，转接后使愈伤组织分化出根和芽，进而培养成瓶苗。但是，在组织培养早期常出现大面积的真菌污染，继代过程中还会出现内生细菌的再次污染，造成了材料的损失，同时浪费了大量的人力物力。野生百合由于生长在野外，无性繁殖的特性使其在生长过程中易不断积累病毒，故长期以来高污染率是困扰野生百合组织培养的难题。目前，对如何降低野生百合组培过程中的污染率已有相关研究报道，一方面是对组培过程各环节进行严格控制，另一方面是使用表面消毒剂对材料进行消毒如抗生素、次氯酸钠、氯化汞等。但这些消毒剂或达不到很好的污染防控作用，或对材料有伤害并对操作人员及环境有危害。因此，如何寻找一种高效易于操作且环境友好型的外植体处理方法，是野生百合组培过程中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种野生百合的组织培养方法，该方法解决了传统野生百合组织培养方法早期易出现的真菌、细菌污染、继代过程中易出现内生菌污染的问题。一种野百合组织培养方法，包括以下步骤(I)取野生百合蒴果，消毒；(2)将消毒后的野生百合蒴果切开，选取生长饱满，胚明显的种子，刮掉种子的种皮，接种于固体培养基中进行暗培养，直至种子萌发；(3)选取萌发形成的芽，接种于固体培养基中进行光照培养，得到鳞茎植株；(4)以鳞茎植株的组织为外植体，诱导培养获得无菌苗。消毒材料直接选用百合蒴果，种子由于蒴果果皮包被，本身带菌少，所得材料经多次继代培养后亦不易出现内生细菌的再生，一般饱满蒴果内含种子80 150粒，数量多，一次性可获得丰富实验材料。所述的消毒方法可以具体为
将野生百合蒴果洗净后置于含洗洁精的水中浸洗20 40min，然后在自来水流下冲洗O. 5 lh，再用75%酒精浸泡O. 5 I. 5min。此消毒方法避免使用氯化汞、次氯酸钠等对环境有害的化合物，去除了消毒剂及无菌水冲洗时间，操作简便，节约人力物力，提高了操作人员的安全性，减少了环境污染。75%的酒精使菌体蛋白质脱水、变性、沉淀的过程缓慢进行，因而渗透性较强，酒精能不断渗入菌体内部，作用于菌体内所有的蛋白质，最后杀死细菌，且杀菌作用比较彻底。将经酒精浸泡的野生百合蒴果置于火焰上灼烧，直至表面酒精完全挥干，灼烧能使表面酒精加速挥发，减少残留酒精对百合蒴果内种子的毒害作用，灼烧本身也能杀死表面的一部分有害菌，利于彻底消毒。所用的野生百合蒴果优选为黄绿色或褐色，果实饱满且未开裂。因蒴果为绿色时，种子过嫩，进行无菌播种不易存活；待蒴果为黄绿色时，内部种子90%以上达到成熟，褐色蒴果内部种子的成熟度更高。蒴果未开裂保证了内部种子始终处于无菌条件，果实饱满保证了内部种子胚的饱满，在无菌播种条件下，种子存活率更高。所述固体培养基的配方为琼脂8 10g/L，MS粉4 5g/L，蔗糖20 30g/L，pH
5.8 6. O。制备方法为将各原料按配比溶于水，在于100 120°C高温灭菌15 20min，冷却凝固即可。胚的发育倾向于黑暗条件，因此暗培养有助于种子的萌发，百合种子的最适合萌发温度为20 25°C。所述光照培养的条件为光照强度1500 20001UX，温度25±2°C。光照和温度影响百合生长的两个重要环境因子，温度过高和过低均不利于百合的生长。所述鳞茎植株的组织为它的鳞片、茎段或叶片。所述诱导培养的培养基配方为MS粉I 2g/L、6-BA I. O 2. Omg/L、NAA0. I O. 5mg/L、鹿糖 25 30g/L、琼脂 8 10g/L。所述诱导培养的培养条件为光照强度1500 20001ux，温度25±2°C。本发明将无菌播种后形成的鳞茎植株组织作为野生百合组织培养的外植体，可以控制污染率在5%以下，有效解决了野生百合初代培养中易出现真菌、细菌污染、继代培养中易出现内生菌污染的问题。
图I为实施例中药百合蒴果外观图像；图2为药百合种子外观图像；图3为药百合种子无菌播种30d后的图像；
图4为药百合芽转接40d后的图像。
具体实施例方式(I)于10月中下旬采收呈黄绿色或褐色，饱满，且未开裂的药百合蒴果。(2)采回的药百合蒴果及时摊开并放置于干净报纸上2 5d后先用软毛刷轻轻刷洗干净，于含I 2滴洗洁精的自来水中浸洗30min左右，再于流水下冲洗lh。(3)在超净工作台上用75%酒精浸泡蒴果45s，用镊子取出置于酒精灯外焰上灼烧至表面酒精挥发干净，无菌水清洗I遍。(4)用手术刀轻轻将药百合蒴果切开，选取胚明显，胚长> 1/2种长的种子(图I)，轻轻刮掉种皮，后播种于含4. 43g/L MS粉，8g/L琼脂，蔗糖20g/L，pH 5. 8 6. O的培养基上进行黑暗培养(温度25±2°C)，每皿9粒种子。8d后种子开始萌发(图3)，14d后50%以上种子萌发，30d后种子萌发率达90%，形成平均长Icm左右的芽。(5)将生长健壮的芽转入相同培养基的柱形瓶中光照培养(光照强度1500 20001UX，温度25±2°C )，每瓶转接4粒，转后40d瓶内形成直径约为O. 5cm的药百合带鳞茎植株，苗高约3 4cm (图4)。(6)将所得药百合鳞茎作为二次外植体，使用23号刀片小心切割成O. 3cmX0. 3cm左右小块，直接接种于药百合诱导培养基(MS粉lg/L、6-BA 2mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L)中诱导培养(培养条件光照强度1500 20001uX，温度25±2°C )，每瓶接种3块，45d左右可形成叶色翠绿、生长健壮的组培植株，整个过程中平均污染率仅为2 %左右(见表I)，且继代中未再次出现内生细菌。表I 二次外植体诱导培养中污染情况
权利要求
1.一种野生百合的组织培养方法，包括以下步骤 (1)取野生百合蒴果，消毒； (2)将消毒后的野生百合蒴果切开，选取生长饱满、胚明显的种子，刮掉种子的种皮，接种于固体培养基中进行暗培养，直至种子萌发； (3)选取萌发形成的芽，接种于固体培养基中进行光照培养，得到鳞茎植株； (4)以鳞茎植株的组织为外植体，诱导培养获得无菌苗。
2.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述的消毒方法为 将野生百合蒴果洗净后置于含洗洁精的水中浸洗20 40min，然后在自来水流下冲洗0.5 lh，再用75%酒精浸泡0. 5 I. 5min。
3.根据权利要求2所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，将经酒精浸泡的野生百合蒴果置于火焰上灼烧，直至表面酒精完全挥干。
4.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所用的野生百合蒴果为黄绿色或褐色，果实饱满且未开裂。
5.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述的固体培养基的配方为琼脂8 10g/L，蔗糖20 30g/L，MS粉4 5g/L，pH 5. 8 6. O。
6.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述暗培养的温度为 25±2°C。
7.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述光照培养的条件为光照强度1500 20001ux，温度25±2°C。
8.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述鳞茎植株的组织为鳞茎植株的鳞片、茎段或叶片。
9.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养的培养基配方为MS 粉 I 2g/L、6-BA I. 0 2. Omg/L、NAA0. I 0. 5mg/L、蔗糖 25 30g/L、琼脂8 10g/L。
10.根据权利要求I所述的野生百合的组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养的培养条件为光照强度1500 20001UX，温度25±2°C。
全文摘要
本发明公开了一种野生百合的组织培养方法，包括取野生百合蒴果，消毒；将消毒后的野生百合蒴果切开，选取生长饱满，胚明显的种子，刮掉种子的种皮，接种于固体培养基中进行暗培养，直至种子萌发；选取萌发形成的芽，接种于固体培养基中进行光照培养，得到鳞茎植株；以所述鳞茎植株的组织为外植体，诱导培养获得无菌苗。本发明将种子无菌播种后形成的鳞茎植株作为间接外植体，有效降低了野生百合组织培养的污染率，且继代过程中不易出现内生菌污染。本方法对外植体材料毒害小，组培成功率较高。
文档编号A01H4/00GK102630567SQ20121011932
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者吴昀, 夏宜平, 常乐, 张琳, 杜方, 郑日如 申请人:浙江大学