野生百合快速繁殖的组织培养方法
【专利摘要】本发明涉及野生百合快速繁殖的组织培养方法，属于花卉培养【技术领域】。本发明方法采用百合的蕾期花梗作为百合组培的外植体，同时在培养前，对花梗作了彻底的消毒，在培养基中除采用6-BA、NAA、IBA作为生长素或激素外，还添加MES作为缓冲剂，有效地控制了组织培养过程中的酸碱度，使pH值长期维持在百合外植体分化、增殖和生长的最适的范围内，提高了诱导效率和增殖系数，诱导率为98～100%，每个外植体诱导的不定芽数不低于15个，增殖系数为5～7，生根率为100%且根系健壮，适用于杂交后代优良单株的安全繁殖，为百合野生资源的保护提供了有效的手段。
【专利说明】野生百合快速繁殖的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及适用于野生百合资源保护性和优良杂交后代快速繁殖的组织培养方法，属于花卉培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]百合是百合科（Liliaceae)百合属（Lilium)植物的总称，其花朵硕大，色彩艳丽，具有很高的观赏、食用及药用价值。全世界百合野生资源约有100种和变种，其中中国原产约55种和变种，品种近万个。百合野生资源的收集与保护是百合育种工作的重要基础，由于人为和自然的影响，一方面自然资源原生境遭破坏严重，许多种类面临灭绝的危险，野生百合种质资源的繁殖保护迫在眉睫。另一方面，现代社会对百合新品种需求旺盛，需要不断快速推出新品种。而传统的百合资源收集、繁殖，均是依靠采挖野生百合种球异地种植或使用种球进行组织培养，由于气候环境条件差异，使得大量野生种球不能在移植圃中存活保存下来，而广泛应用的基于种球鳞片的组织培养也常常因为其携带的各类共生或非共生真菌、细菌而出现大量初代污染，导致材料废弃。如此一来，导致重复野外采集，极易对一些重要稀有资源造成毁灭性破坏。同样情况，也发生在杂交育种优良后代选择繁育环节中。
[0003]已有许多通过组织培养的方法对百合野生资源进行收集和保护的研究，主要都是以种球鳞片为外植体。熊丹等(熊丹，陈发菊，梁宏伟，等.宜昌百合的组织培养研究福建林业科技，2007，34 (4) :91-94)以鳞片为外植体对宜昌百合进行了组织培养研究。邱宁宏等(邱宁宏，罗林会，王勤，等.淡黄花百合的组织培养与快速繁殖中国野生植物资源，2004，23(2) :64-65)选取鳞片为外植体，筛选出了适合淡黄花百合的组织培养条件。赵强等(赵强，李庆典，赵玉岭.青岛百合的组织培养技术研究北方园艺，2007,6:213-214)以青岛百合的鳞片为外植体，研究了青岛百合的组织培养体系。Bakhshaie等（Bakhshaie M, BabalarM, Mirmasoumi M, et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Liliumledebourii (Baker) Boiss. , an endangered species. Plant Cell, Tissue and OrganCulture (PCTOC), 2010,102 (2) : 229-235.)利用鳞片为外植体，通过诱导出胚型愈伤途径，建立了莉黛柏蕊百合（Li`lium ledebourii (Baker)Boiss.)的再生体系。陈丽静等（陈丽静，葛菱，张丽朝.鲜百合鳞茎诱导及再生体系建立中国农学通报，2011,27 (19) : 121-124)以朝鲜百合的鳞茎为外植体，建立了朝鲜百合的再生体系建立。马素娴等(马素娴，田志强，亢秀萍.山西野生卷丹百合鳞茎组织培养山西农业科学，2012,40(4) :319-321)以卷丹百合鳞莖鳞片为外植体，探讨影响其分化的主要因素。Burun等（Burun B, Sahin
0.Micropropagation of Lilium candidum L. :a rare and native bulbous flower ofTurkey. Bangladesh Journal of Botany, 2013,42 (I) : 185-187.)以圣母百合（Liliumcandidum L.)的鳞片为外植体，建立了圣母百合的组织扩繁体系。
[0004]百合的鳞茎在离体的条件下，在合适浓度的合适激素的诱导下，会诱导产生不定芽或产生愈伤组织。诱导出的愈伤组织经过分化培养可以分化出不定芽，不定芽进过增殖培养之后，再进行生根诱导，可获得完整植株，从而达到组织快速繁殖的目的。[0005]百合资源调查、收集工作通常在花期进行，因为花期百合花容易在繁杂的植被丛中被发现。而果期很难找到百合植株，一般在野外采收种子的难度很大。所以，通常是在花期采挖种球(鳞茎）进行移植或组织培养。但是，花期百合移植成活率极低。
[0006]通常对百合野生资源的组织培养过程中，均选择百合的鳞片做外植体。这样就要将百合球挖出带走，破坏了野生资源。此外，百合鳞茎生长在土壤中，土壤中的微生物种类丰富，鳞片上带有很多种类真菌或细菌，在进行初代培养时污染率极高。
[0007]如果以地上部分组织如花器官作为外植体，那显然可以减少在花期资源调查时以采挖种球收集资源材料对资源的破坏，同时，还可能减少外植体带菌的量，从而减少初代培养的污染损失。同样也适宜于优良杂交后代植株繁殖。
[0008]已报道的以花器官为外植体的试验均集中在现代栽培品种(如：‘索邦’、‘西伯利亚’)和磨香(铁炮）百合（lilium Iongiflorum),而且分化率均在90%以下,仅有钟海丰等(钟海丰，黄宇翔，钟淮钦，叶秀仙，黄敏玲.新铁炮百合花器官组织培养研究.福建农业学报，2010，25 (2) :207~21，·）的分化率达到90. 8%，但不定芽的增殖率最高只有4. 8%，且生长势较弱。如果用在野生百合资源培养还涉及到初代污染问题，但均未见报导。刘雅莉，张剑侠，潘学军(刘雅莉，张剑侠，潘学军.东方百合’索邦’的花器官培养与快速繁殖.西北植物学报，2004，24 (12) ：2350~2354.)以东方百合‘索邦’的花梗、花托、花瓣和花丝为外植体进行了离体培养与快速繁殖研究。结果表明：4种花器官均可直接诱导产生不定芽，其中花梗在N6基本培养基上诱导率为75. 8%，MS上为72. 2%。赖钟雄等(赖钟雄，郑香洪，张春镇，陈发兴，林庆良，吴金寿.麝香百合花梗离体培养再生植株.福建农林大学学报(自然科学版）.2004，33 (2):186~188.)以麝香百合的花梗为外植体进行了离体培养再生植株的研究.结果表明在附加2mg. L-1ΒΑ+Ο. lmg. T1NAA的MS培养基花梗培养产生小鳞茎的诱导率可高达86. 67%。在附加O. Smg^1BA的MS培养基上继代，增殖系数最高达5.1在附加O. 5mg. T1NAA的1/2MS培养基上培养生根，生根率90%以上。林斯专等(林斯专，郑香洪，陈发兴.麝香百合花梗组培快繁.福建果树，2004. 128 (1):8~10.)认为花梗是麝香百合地上都诱导愈伤组织的最适器官，其不定芽分化的最佳培养基配方为MS+BA 2mg.I/1+NAA O. lmg. L-1 ;以花梗为外植体的不定芽的分化率达到86. 67%，增殖培养基以MS+BA
0.Smg.!/1为宜，繁殖系数达5. I。芽苗生长势强。王惠和贾桂霞(王惠，贾桂霞.‘西伯利亚’百合多种外植体的组织培养研究.中国观赏园艺研究进展2007. 185~190.)以‘西伯利亚’的花梗、花丝、子房作为外植体，子房分化能力最强，其中花梗最高分化率50%，子房 58. 3%。诱导其分化的最佳培养基为 MS+6-BA lmg. L-1+NAA O. lmg. L_1+2,4-D O. lmg. L'许洁婷等(许洁婷，王月，唐克轩，唐东芹.麝香百合花部组织离体培养与植株再生.上海交通大学学报（农业科学版），2008，26 (1) :13~16.)以麝香百合幼嫩花部组织为外植体进行离体培养。研究了不同部位外植体和植物生长调节物质时其愈伤组织的诱导及植株再生的影响。结果表明。不同外植体诱导愈伤组织的能力不同。由强到弱依次为花丝>花托 > 花梗 > 花柱 > 花瓣。在愈伤组织诱导过程中。花丝、花托及花梗在培养基MS+NAA
1.Omg. L-1+BA O. 5mg. L-1 上的诱导率都高达 80%。交替在 MS+NAA 1.0mg. L_1+BA O. 5mg. L-1和MS+NAA O. 5mg. L-1+ΒΑ 0. 25mg. L-1两种培养上培养最有利于愈伤组织的增殖。不定芽的分化以MS+KT 1.0mg. r+NAA O. 5mg. L-1最佳。生根培养基以MS+NAA O. 2mg. L-1效果为好。其中花梗诱导率84. 17%。钟海丰等(钟海丰，黄宇翔，钟淮钦，叶秀仙，黄敏玲.新铁炮百合花器官组织培养研究.福建农业学报，2010，25 (2) :207~21，.）以新铁炮百合的花梗、花托、花瓣、花丝和花柱（去除柱头）为外植体，进行离体培养及快速繁殖研究。结果表明5种花器官均能直接诱导产生不定芽，其诱导能力大小为花托 > 花梗 > 花丝 > 花瓣、花柱。其中花梗诱导率为90.8%。诱导不定芽的适宜培养基为：MS+2. Omg. L_1 6-BA+O. 2mg. T1NAA。但不定芽的增殖率最高只有4. 8%，且生长势较弱。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供百合花梗组织培养方法，以达到在不破坏百合野生资源的情况下，保证安全、可靠地获得野生百合种质资源组培苗，从而实现对野生百合资源进行有效保护。
[0010]野生百合快速繁殖的组织培养方法，包括如下步骤：
[0011](1)取蕾期幼嫩花梗，消毒除杂菌，
[0012](2)将幼嫩花梗纵切成两半，再切成段，将纵切面放置于诱导培养基上进行诱导培养出不定芽，
[0013](3)将诱导出的不定芽接到增殖培养基上进行增殖培养，获得丛生芽，
[0014](4)将丛生芽接到生根培养基上进行生根培养，获得根系健壮的无菌组培苗。
[0015]所述诱导培养基为:MS+6_BAO. 5mg. L :+NAA I. 5mg. L k 鹿糖 30. 0 g. L ^MES2g. L—1+琼脂 6. Og. L^pH=S. 8 ~6· O ;增殖培养基为 MS+IBA O. lmg. L—1+蔗糖 60. 0 g. L_1+MES2g. L-1+ 琼脂 6. Og. ΙΛ ρΗ=5· 8 ~6· O ;生根培养基为：1/2MS+IBA O. lmg. L-1+NAA O. lmg.L-1+MES 2g. L-1+ 蔗糖 60.0g. L-1+ 琼脂 6. Og. ?Λ ρΗ=5. 8 ~6· O。
[0016]所述诱导培养条件为培养条件是温度（25±2) °C ,遮光,增殖培养条件为培养条件是温度（25±2) °C，遮光，生根培养条件为培养条件是温度（25±2) °C，光照（光照强度20001x，光 / 暗周期 16h/8h)。
[0017]所述消毒采取如下顺序步骤：先将幼嫩花梗置于含有50%多菌灵500倍液、50mg.L-1链霉素和50mg. L-1青霉素的水溶液中，150rpm振荡3~5h进行前消毒处理；然后将花梗置于75%酒精中浸泡震荡20~30s，最后放入10%次氯酸钠溶液中浸泡震荡13min，用无菌水冲洗3次，每次冲洗I~2min。
[0018]所述切段的长度为1cm。
[0019]本方法选用百合的蕾期花梗作为百合组培的外植体，避免了对百合野生资源的破坏，而且花梗为地上组织，带菌少，以花梗作为外植体时的初代培养污染率较低，分化率高。在培养基中添加MES缓冲剂，有利于高诱导率和增殖系数的获得，为百合野生资源的保护提供了有效的手段。
[0020]本发明所选用的花梗是蕾期幼嫩的材料，幼嫩的组织材料再生能力较老化组织强。
[0021]外植体的彻底消毒是保证得到无菌苗的关键。前消毒条件是将花梗置于含有50%多菌灵500倍液、50mg. L_1农用链霉素和50mg. L_1农用青霉素的水溶液中，150rpm振荡3~5h。多菌灵是一种广谱性杀真菌剂，其作用原理为干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂，从而起到杀真菌的作用。青霉素是一种主要对革兰氏阳性菌有强大抗菌作用，对一些革兰氏阴性菌也有较强作用的β_内酰胺类抗生素，农用链霉素是一种主要对一些革兰氏阴性菌有较强抗菌作用氨基糖苷类抗生素。将三种不同类型的杀菌剂混合使用可以针对不同类型的细菌和真菌同时进行全面灭菌从而降低外植体在初代培养中的污染率；外植体后消毒条件是75%酒精中浸泡震荡20~30s，10%次氯酸钠溶液，浸泡震荡13min。次氯酸纳是一种氧化性杀菌剂，但是在杀灭细菌和真菌的同时也会对植物细胞造成伤害，用次氯酸钠消毒的时间过短，则达不到彻底灭菌的效果；灭菌时间过长则会对外植体造成伤害。优选的百合花梗进行次氯酸钠消毒的时间是13min，次氯酸钠浓度时10%。花梗灭完菌之后，要清洗干净残留的次氯酸钠，以免对外植体造成伤害。优选的洗涤方式是无菌水冲洗3次，冲洗时间I~2min。
[0022]以花梗作为外植体进行初代培养时，要将花梗纵切成两半，纵切面接触培养基。这样有利于不定芽的产生。优选的花梗长度是Icm左右。
[0023]pH值是影响外植体分化生长的关键因素，大量研究表明pH在5. 8~6. O时有利于百合花梗外植体的分化及生长。外植体在培养的过程中，会分泌许多代谢产物与培养基中，从而改变培养基的pH，不利于外植体的分化及生长，MES的名称为2-(N-吗啡啉）乙磺酸，是一种酸性缓冲液，当培养基加入一定浓度MES时，可以使培养基的pH值维持在一定范围之内。优选的MES浓度为2g. L-I。
[0024]本发明方法采用百合的蕾期花梗作为百合组培的外植体，同时在培养前，对花梗作了彻底的消毒，在培养基中除采用6-BA、NAA、IBA作为生长素或激素外，还添加MES作为缓冲剂，有效地控制了组织培养过程中的酸碱度，使PH值长期维持在百合外植体分化、增殖和生长的最适的范围内，提高了诱导效率和增殖系数，诱导率为98~100%，每个外植体诱导的不定芽数不低于15个，增殖系数为5~7，生根率为100%且根系健壮，适用于杂交后代优良单株的安全繁殖，为百合野生资源的保护提供了有效的手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图I为实施例I中淡`黄花百合（Lilium sulphureum Baker)花梗外植体诱导培养20d时情况。
[0026]图2为实施例I中淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker)花梗外植体诱导培养35d时情况。
[0027]图3为实施例I中淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker)不定芽增殖培养23d情况。
[0028]图4为实施例I中淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker)丛生芽诱导生根培养30d情况。
[0029]图5为实施例2中宜昌百合（Lilium leucanthum (Baker) Baker)花梗外植体诱导培养34d时情况。图6为实施例2中宜昌百合（Lilium leucanthum (Baker) Baker)不定芽增殖培养20d情况。
[0030]图I为实施例2中宜昌百合（Lilium leucanthum (Baker) Baker)丛生芽诱导生根培养32d情况。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例，对本发明的技术方案做进一步详细描述。[0032]野生百合快速繁殖的组织培养方法，包括如下步骤：
[0033]I)取蕾期幼嫩花梗置于含有50%多菌灵500倍液、50mg. l1农用链霉素和50mg.L-1农用青霉素的水溶液中，150rpm振荡3~5h进行前消毒处理；
[0034]2)将前处理过的花梗置于75%酒精中浸泡震荡20~30s，再放入10%次氯酸钠溶液中浸泡震荡13min，用无菌水冲洗3次，每次冲洗I~2min ；
[0035]3)切取幼嫩花梗，纵切成两半，切成一厘米左右，将花梗的纵切面放置于诱导培养基上进行诱导培养，培养条件是温度（25±2) °C，遮光； [0036]4)诱导出的不定芽转接到增殖培养基上进行增殖培养，获得丛生芽，培养条件是温度（25±2) °C，遮光；
[0037]5)将丛生芽移接到生根培养基上进行生根，获得无菌苗。培养条件是温度(25±2) °C，光照(光照强度20001x，光/暗周期16h/8h)。
[0038]其中，所述花梗的诱导培养基为：MS+6-BA O. 5mg. 1'+ΝΑΑ I. 5mg. L—1+蔗糖30.0g.L^+MES 2g. L—1+琼脂 6. Og. L—1，pH=5. 8 ~6. 0 ;不定芽的增殖培养基为 MS+IBA O. lmg. L—1+蔗糖 60. 0g. L_1+MES 2g. l1+ 琼脂 6. 0g. L_1,pH=5. 8 ~6· 0 ;生根培养基为：1/2MS+IBA O. lmg.L-1+NAA O. lmg. L_1+MES 2g. L-1+ 蔗糖 60.0g. L-1+ 琼脂 6. Og. ?Λ ρΗ=5. 8 ~6· O。
[0039]实施例I
[0040]I)将从云南采集的淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker)的幼嫩花梗置于含有50%多菌灵500倍液、50mg. l1农用链霉素和50mg. l1农用青霉素的水溶液中，150rpm振荡3h进行前消毒处理；
[0041]2)将前处理过的花梗置于75%酒精中浸泡震荡20s，再放入10%次氯酸钠溶液中浸泡震荡13min，用无菌水冲洗3次，每次冲洗Imin ；
[0042]3)切取幼嫩花梗，纵切成两半，切成一厘米左右，将花梗的纵切面放置于诱导培养基（MS+6-BA O. 5mg. L_1+NAA I. 5mg. L-1+蔗糖 30. 0g. L-1+MES 2g. L-1+琼脂 6. 0g. l1，ρΗ=5. 8~6. O)上进行诱导培养，培养条件是温度（25±2) °C，遮光；如图I、图2所示
[0043]4)5d后，诱导出不定芽，将诱导出的不定芽转接到增殖培养基（MS+IBA O. Img.l1+ 蔗糖 60. 0g. L^+MES 2g. L-1+ 琼脂 6. Og. ?ΛρΗ=5· 8 ~6· O)上进行增殖培养，34 d 获得丛生芽。培养条件是温度（25±2)°C，遮光；如图3所示，
[0044]5)将丛生芽移接到生根培养基(1/2MS+IBA O. lmg. L^+NAA O. lmg. L-1+蔗糖60. 0g. r1+MES2g. L-1+琼脂6. 0g. L-1，pH=5. 8~6. O)上进行生根培养，生根培养的培养条件：温度（25±2) °C，光照(光照强度20001x，光/暗周期16h/8h);如图4所示。
[0045]本实验污染率为0%，不定芽诱导率为100%，增值系数为5. 5，生根率为100%(表1)。Icm左右的花梗初代培养之后平均能获得25个不定芽。
[0046]表1淡黄花百合花梗不定芽诱导分化增殖情况
[0047]
【权利要求】
1.野生百合快速繁殖的组织培养方法，包括如下步骤： (1)取蕾期幼嫩花梗，消毒除杂菌， (2)将幼嫩花梗纵切成两半，再切成段，将纵切面放置于诱导培养基上进行诱导培养出不定芽， (3)将诱导出的不定芽接到增殖培养基上进行增殖培养，获得丛生芽， (4)将丛生芽接到生根培养基上进行生根培养，获得根系健壮的无菌组培苗。 所述诱导培养基为：MS+6-BA O. 5mg. L、NAA I. 5mg. L1+ 蔗糖 30.0 g. L_1+MES 2g. L1+琼脂 6. Og. ΙΛ ρΗ=5· 8 ~6. O ;增殖培养基为 MS+IBA O. lmg. L1+ 蔗糖 60.0 g. L_1+MES2g. L-1+ 琼脂 6. Og. ΙΛ ρΗ=5· 8 ~6· O ;生根培养基为：1/2MS+IBA O. lmg. L-1+NAA O. lmg.L-1+MES 2g. L-1+ 蔗糖 60. 0g. L-1+ 琼脂 6. O g. ?Λ ρΗ=5. 8 ~6· O。
2.根据权利要求1所述的方法，所述诱导培养条件为培养条件是温度（25±2)°C，遮光，增殖培养条件为培养条件是温度（25±2) °C ,遮光，生根培养条件为培养条件是温度(25±2) °C，光照强度20001x，光/暗周期16h/8h。
3.根据权利要求1所述的方法，所述消毒采取如下顺序步骤：先将幼嫩花梗置于含有50%多菌灵500倍液、50mg. L—1链霉素和50mg. L—1青霉素的水溶液中，150rpm振荡3~5h进行前消毒处理；然后将花梗置于75%酒精中浸泡震荡20~30s，最后放入10%次氯酸钠溶液中浸泡震荡13min，用无菌水冲洗3次，每次冲洗I~2min。
4.根据权利要求1所述的方法，所述切段的长度为1cm。
【文档编号】A01H4/00GK103704136SQ201310722214
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】明军, 袁素霞, 刘春 , 徐雷锋 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所