专利名称：一种研究黄芩组织培养快速繁殖的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，尤其涉及一种研究黄芩组织培养快速繁殖的方法。
背景技术：
黄芩具有清热泻火、消炎镇痛等药理作用，在临床上疗效确切，作为常用的药材品种，应用历史悠久，需求数量较大。目前，黄芩产业已经形成具有一定规模、结构较为完整的产业体系，特别是近年来呈现出快速增长态势，成为医药经济产业中重要的组成部分。近几年来，市场上对黄芩供不应求的矛盾日益突出，这是由于临床上对黄芩药材的需求量逐年上升，而现实是有限的黄芩野生资源遭到掠夺性挖掘后的日益匮乏，同时该植物繁殖速度慢，加之少有栽培，并且缺乏可行的组织培养技术对黄芩进行繁殖，尚未获得黄芩愈伤组织诱导的最佳外植体及培养基配方。
发明内容
本发明提供了一种研究黄芩组织培养快速繁殖的方法，旨在解决目前黄芩的野生资源日益匮乏，繁殖速度慢，加之少有栽培，市场上供不应求的矛盾日益突出，并且缺乏可行的组织培养技术对黄芩进行繁殖，尚未获得黄芩愈伤组织诱导的最佳外植体及培养基配方的问题。本发明的目的在于提供一种研究黄芩组织培养快速繁殖的方法，所述方法包括以下步骤对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体；对外植体进行消毒处理；对培养基配方进行筛选；对黄芩的愈伤组织进行诱导；筛选出最佳外植体和最佳激素组合。本发明提供的研究黄芩组织培养快速繁殖的方法，首先对黄芩的种子进行处理， 获得接种外植体，其次对外植体进行消毒处理，同时设计培养基配方，在无菌条件下对黄芩的愈伤组织进行诱导，筛选出最佳外植体和最佳激素组合，为利用组织培养技术对黄芩进行快速、大规模繁殖提供了可能，有效地解决了目前黄芩的野生资源日益匮乏，繁殖速度慢，市场供不应求等日益突出的矛盾，同时也解决尚未获得黄芩愈伤组织诱导的最佳外植体及培养基配方等问题，方法简单可行，操作性强，为建立黄芩组培再生体系奠定了基础。
图1示出了本发明实施例提供的研究黄芩组织培养快速繁殖的方法的实现流程图；图2示出了本发明实施例提供的对外植体进行消毒处理的实现方法的流程图3示出了本发明实施例提供的对培养基配方进行筛选实现方法的流程图；图4示出了本发明实施例提供的对黄芩的愈伤组织进行诱导的实现方法的流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定发明。图1示出了本发明实施例提供的研究黄芩组织培养快速繁殖的方法的实现流程。该方法包括以下步骤在步骤SlOl中，对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体；在步骤S102中，对外植体进行消毒处理；在步骤S103中，对培养基配方进行筛选；在步骤S104中，对黄芩的愈伤组织进行诱导；在步骤S105中，筛选出最佳外植体和最佳激素组合。在本发明实施例中，对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体的实现方法为将种子在光照培养箱中培养，白天温度为25°C左右，光强2000 25001x光照12 小时，晚上为20°C左右，每天浇水一次，保持相对湿度70% 80%左右。待黄芩种子发芽长出4 6片真叶时，取植株的根尖、茎及叶片作为接种的外植体。如图2所示，在本发明实施例中，对外植体进行消毒处理的实现方法为在步骤S201中，将黄芩幼苗从培养箱中取出，放入盆中，用自来水冲洗；在步骤S202中，待泥沙冲洗干净后取出，放入白瓷盘置于超净工作台上，取灭菌过的三角烧瓶将幼苗放入，用75%的酒精浸泡10s，弃酒精，用无菌水冲洗3次；在步骤S203中，紧接着用0. 升汞消毒10 12min ； 在步骤S204中，去升汞后再用无菌水冲洗5 6次，置于无菌的培养皿中，获得无菌外植体进行接种。如图3所示，在本发明实施例中，对培养基配方进行筛选实现方法为在步骤S301中，经预实验后选6个不同激素组合配方进行外植体接种；在步骤S302中，在比较了愈伤组织诱导效果后，从以上6个不同激素组合配方中选出一个配方；在步骤S303中，再进行梯度试验确定适宜黄芩愈伤组织诱导的最佳培养基配方。在本发明实施例中，6个不同激素组合配方如下配方1 :MS+NAA 0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L ；配方2:MS+NAA 1. 0mg/L+2,4D 1· Omg/L+6-BA 1. Omg/L ；配方3 :MS+NAA 1. Omg/L+TDZ 1. Omgm ；配方4 :MS+NAA0. 5mg/L+6_BA 0. 5mg/L ；配方5 :MS+IBA0. 5mg/L+6_BA 0. 5mg/L ；配方6 :MS+IBA0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L。
如图4所示，在本发明实施例中，对黄芩的愈伤组织进行诱导的实现方法为在步骤S401中，选取黄芩无菌外植体，即取根、茎、叶各部分，分别将茎和根切成 2cm左右长的小段，叶片切成0. 5cmX0. 5cm小块，并在上划上创伤口 ；在步骤S402中，将处理好的材料分别接种在6个不同配方的培养基上，每个配方的培养基接种根、茎、叶各15瓶，每瓶接种外植体约6 8个；在步骤S403中，诱导愈伤组织的条件为25°C培养箱中采用暗培养；在步骤S404中，暗培养30天后，统计各处理的愈伤组织诱导率。在本发明实施例中，诱导率的计算方法为诱导率％ =(形成愈伤组织外植体块数/种外植体块数)X 100在本发明实施例中，筛选最佳激素组合的浓度的实现方法为
将最适激素组合设置4个不同的浓度梯度进行试验；采用根、茎、叶中诱导率较高者做外植体，在以上4个不同浓度激素组合的培养基上接种；暗培养30天后，统计并计算黄芩愈伤组织诱导率。在本发明实施例中，4个不同的浓度梯度如下1)MS+NAA 0. 25mg/L+X 0. 25mg/L ；2)MS+NAA 0. 25mg/L+X 0. 5mg/L ；3)MS+NAA0. 5mg/L+X lmg/L ；4)MS+NAA 0. 25mg/L+X lmg/L ；其中X为 6_BA、KT、TDZ 中的一者。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。本发明实施例提供的研究黄芩组织培养快速繁殖的方法，首先对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体，其次对外植体进行消毒处理，同时设计培养基配方，在无菌条件下对黄芩的愈伤组织进行诱导，筛选出最佳外植体和最佳激素组合，为利用组织培养技术对黄芩进行快速、大规模繁殖提供了可能，有效地解决了目前黄芩的野生资源日益匮乏，繁殖速度慢，市场供不应求等日益突出的矛盾，同时也解决尚未获得黄芩愈伤组织诱导的最佳外植体及培养基配方等问题，方法简单可行，操作性强，为建立黄芩组培再生体系奠定了基石出。以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种研究黄芩组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体；对外植体进行消毒处理； 对培养基配方进行筛选； 对黄芩的愈伤组织进行诱导； 筛选出最佳外植体和最佳激素组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体的实现方法为将种子在光照培养箱中培养，白天温度为25°C左右，光强2000 25001x光照12小时， 晚上为20°C左右，每天浇水一次，保持相对湿度70% 80%左右。待黄芩种子发芽长出4 6片真叶时，取植株的根尖、茎及叶片作为接种的外植体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对外植体进行消毒处理的实现方法为 将黄芩幼苗从培养箱中取出，放入盆中，用自来水冲洗；待泥沙冲洗干净后取出，放入白瓷盘置于超净工作台上，取灭菌过的三角烧瓶将幼苗放入，用75%的酒精浸泡10s，弃酒精，用无菌水冲洗3次； 紧接着用0. 升汞消毒10 12min ；去升汞后再用无菌水冲洗5 6次，置于无菌的培养皿中，获得无菌外植体进行接种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对培养基配方进行筛选实现方法为 经预实验后选6个不同激素组合配方进行外植体接种；在比较了愈伤组织诱导效果后，从以上6个不同激素组合配方中选出一个配方； 再进行梯度试验确定出适宜黄芩愈伤组织诱导的最佳培养基配方。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述6个不同激素组合配方如下 配方 1 :MS+NAA 0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L ；配方 2:MS+NAA 1. 0mg/L+2，4-D 1. Omg/L+6-BA 1. Omg/L ； 配方 3 :MS+NAA 1. Omg/L+TDZ 1. Omg/L ； 配方 4 :MS+NAA0. 5mg/L+6-BA 0. 5mg/L ； 配方 5 :MS+IBA0. 5mg/L+6-BA 0. 5mg/L ； 配方 6 :MS+IBA0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对黄芩的愈伤组织进行诱导的实现方法为选取黄芩无菌外植体，即取根、茎、叶各部分，分别将茎和根切成2cm左右长的小段，叶片切成0. 5cmX0. 5cm小块，并在上划上创伤口 ；将处理好的材料分别接种在6个不同配方的培养基上，每个配方的培养基接种根、茎、 叶各15瓶，每瓶接种外植体约6 8个；诱导愈伤组织的条件为25°C培养箱中采用暗培养； 暗培养30天后，统计各处理的愈伤组织诱导率。
7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述诱导率的计算方法为 诱导率％ =(形成愈伤组织外植体块数/接种外植体块数)X 100。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选最佳激素组合的浓度的实现方法为将最适激素组合设置4个不同的浓度梯度进行试验；采用根、茎、叶中诱导率较高者做外植体，在以上4个不同浓度激素组合的培养基上接种；暗培养30天后，统计并计算黄芩愈伤组织诱导率。
9.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述4个不同的浓度梯度如下 DMS+NAA 0. 25mg/L+X 0. 25mg/L ；2)MS+NAA0. 25mg/L+X 0. 5mg/L ；3)MS+NAA0.5mg/L+X lmg/L ；4)MS+NAA0. 25mg/L+X lmg/L ； 其中=X为6_BA、KT、TDZ中的一者。
全文摘要
本发明属于植物组织培养领域，提供了一种研究黄芩组织培养快速繁殖的方法，首先对黄芩的种子进行处理，获得接种外植体，其次对外植体进行消毒处理，同时设计培养基配方，在无菌条件下对黄芩的愈伤组织进行诱导，筛选出最佳外植体和最佳激素组合，为利用组织培养技术对黄芩进行快速、大规模繁殖提供了可能，有效地解决了目前黄芩的野生资源日益匮乏，繁殖速度慢，市场供不应求等日益突出的矛盾，同时也解决尚未获得黄芩愈伤组织诱导的最佳外植体及培养基配方等问题，方法简单可行，操作性强，为建立黄芩组培再生体系奠定了基础。
文档编号A01H4/00GK102550422SQ201210057290
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者于浩, 吴俊燕, 徐根娣 申请人:浙江师范大学