一种红根野蚕豆组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培养方法，具体涉及一种红根野蚕豆组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。
【背景技术】
[0002]红根野蚕豆，植物界中被子植物门、双子植物纲、玄参科、野蚕豆属、红根野蚕豆种，又名滑野蚕豆、大花胡麻草、小红药等，为玄参科植物红根野蚕豆全草，性温、味酸、微辛，用于散瘀止血、消肿止痛；主治咯血、咳血、吐血、妇女闭经、内伤瘀血、中老年人风湿痹痛、筋骨痛、脑血栓、脑溢血、酒精肝等。作为一种名贵中药材，现今由于自然繁殖能力低市场需求大，人类的过度采摘等原因导致自然资源稀缺，无法满足人类对红根野蚕豆的药用需求。
[0003]19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
[0004]植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养即植物无菌培养技术，广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术；狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
[0005]中国中药杂志2003年12月第28卷第12期，薛建平、葛德燕等对玄参科地黄组织培养的研宄进行了阐述。1983年，毛文岳等人就对地黄的组织培养进行了研宄，其中吴美芳等人以怀地黄北京一号，新鲜的块根为外植体进行培育，得出完整植株；毛文岳等以地黄茎尖为外植体进行培养也获得了地黄完整植株。迄今为止国内外对地黄、金鱼草、玄参等玄参科植物组织培养方面都取得了显著的成功。
[0006]虽然地黄、金鱼草等都是玄参科植物，现今国内外对地黄、金鱼草等玄参科植物组织培养研宄也相当成熟，但是红根野蚕豆作为一种名贵而稀缺的中药材，其组织培养在国内外仍然是一片空白，现今红根野蚕豆的繁殖方法还停留在种子土播的繁殖方式上，这种方法具有成本高、发芽率低、不易成活(成活率低于百分之一)的缺点。鉴于这些传统的繁殖方式上的缺点和不足，急待研宄出一套适合红根野蚕豆组织培养技术，用于解决红根野蚕豆自然繁殖能力低的问题，从而在一定程度上满足人类对红根野蚕豆的需求，为中药材发展带来更大的社会效益和经济效益。
[0007]植物组织培养方法的专利很多，中国发明“一种玉米的组织培养方法”，申请号201210011592.8通过基因改良与组织培养，以实现玉米的人工快速繁育；中国发明“一种草莓继代培养方法”，申请号201310212115.2采用低温-常温的培养条件，大幅度提高体细胞胚的成熟率，但是红根野蚕豆组织培养的方法还未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是克服现有技术的缺点和不足，提供一种红根野蚕豆组织培养方法，用于解决红根野蚕豆自然繁殖能力低的问题。
[0009]为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下:
[0010]一种红根野蚕豆组织培养方法，包括如下步骤:
[0011](I)外植体的处理和保存:将从野外采摘回来的红根野蚕豆种子作为外植体，夕卜植体用84消毒液的100倍稀释液浸泡8?15分钟，再用自来水冲洗0.5?I小时，置于干净的玻璃器皿内备用，未用完的放于冰箱内保存以便日后使用；
[0012](2)外植体的灭菌:将处理过的外植体置于超净工作台上，用75%的酒精消毒25?35秒，再在体积浓度为0.1 %的升未中浸泡8?10分钟后，用无菌水冲洗2?4次；
[0013](3)外植体接种:将上述灭菌过的外植体破壳接种于培养瓶中，培养基采用诱导培养基一号，并进行封口标记；
[0014](4)组织培养:将接种好的培养瓶置于25?35 °C的黑暗温室中培养5?8天，再置于25?35°C的光照温室中培养25?40天，得到红根野蚕豆种苗；
[0015](5)继代培养:将培养好的平均株高5?6cm的红根野蚕豆种苗在超净工作台上用接种工具以节为单位进行切割，将切割好的茎段接种于诱导芽和根的培养基二号中，并进行封口 ；将接种好的苗置于20?30°C的黑暗温室中培养5?8天后，再置于25?30°C的光照温室中培养30?50天，得到红根野蚕豆的完整植株；
[0016](6)炼苗和移栽:将培养好的红根野蚕豆完整植株置于温室大棚内进行5?8天的炼苗后，进行移栽。
[0017]步骤(3)所述的诱导培养基一号由如下成分组成:以一升计算:常量元素为:NH4N03750 ?850mg、KN03900 ?1000mg、Cal2.2Η20 200 ?250mg、MgS04.7Η20 150 ?200mg、KH2P04320 ?380mg ;微量元素:KI 0.80 ?0.85mg、H3B036.0 ?6.5mg、MnSO4.4Η20 22.0 ?22.5mg、ZnSO4.7H20 8.3 ?8.8mg、Na2MnO4.2H20 0.22 ?0.28mg、CuSO4.5H20 0.022 ?0.028mg、CoCl2.6H20 0.022 ?0.028mg、FeSO4.7H20 27.5 ?28mg、Na2-EDTA.2H20 37 ?37.5mg ;有机成分:肌醇80?120mg、烟酸(λ 3?0.8mg、盐酸吡哆醇(维生素Β6)0.3?0.8mg、盐酸硫胺素(维生素BI) 0.3?0.8mg、甘氨酸I?3mg、鹿糖25?35g、马铃薯45?55g、琼脂3?8g、余量为蒸馏水；PH值5.8。
[0018]步骤(5)所述的诱导芽和根的培养基二号由如下成分组成:以一升计算:常量元素为:NH4N03750 ?850mg、KN031800 ?2000mg、Cal2.2H20 420 ?460mg、MgSO4.7H20320 ?360mg、KH2P046 50 ?750mg ;微量元素:KI 0.80 ?0.85mg、Η3Β036.0 ?6.5mg、MnSO4.4Η2022.0 ?22.5mg、ZnSO4.7H20 8.3 ?8.8mg、Na2MnO4.2H20 0.22 ?0.28mg、CuSO4.5H200.022 ?0.028mg、CoCl2.6Η20 0.022 ?0.028mg、FeS04.7Η20 27.5 ?28mg、Na2_EDTA.2Η2037?37.5mg ;有机成分:肌醇80?120mg、烟酸0.3?0.8mg、盐酸P比B多醇(维生素B6) 0.3?0.8mg、盐酸硫胺素(维生素BI) 0.3?0.8mg、甘氨酸I?3mg、矮壮素0.8?1.2g、香蕉60?80g、马铃薯45?55g、鹿糖25?35g、碳粉0.8?1.2g、琼脂3?8g、余量为蒸馏水；PH值5.8。
[0019]步骤(3)所述的诱导培养基一号还可以用下列培养基:(l)MS+0?8%马铃薯+0?8%椰子汁+3?5%蔗糖+0.4?0.6%琼脂，PH值5.0-6.0 ；⑵1/2MS+0?8%马铃薯+0?8%椰子汁+3?5%蔗糖+0.4?0.6%琼脂，PH值5.0-6.0 ； (3)N6+0?8%马铃薯+0?8%椰子汁+3?5%蔗糖+0.4?0.6%琼脂，PH值5.0-6.0。
[0020]步骤(5)所述的诱导芽和根的培养基二号还还可以用如下培养基:(l)MS+0.1?0.8mg/16_BA+0.0 ?0.5mg/l NAA+6 ?8% 香焦 +0.5 ?lg/Ι 矮壮素 +0.1 ?0.3% 碳粉+0.4 ?0.6%琼脂+3 ?5%蔗糖、PH 值 5.0-6.0 ； (2) 1/2MS+0.1 ?0.8mg/l 6-BA+0.0 ?0.5mg/l NAA+6?8%香焦+0.5?lg/Ι矮壮素+0.1?0.3%碳粉+0.4?0.6%琼脂+3?5%蔗糖，PH 值 5.0-6.0o
[0021]步骤(4)所述光照温室的光照强度为1500?25001x，光照时间为5?10小时。
[0022]步骤(5)所述的光照室温的光照强度为2000?30001x，光照时间5?10小时。
[0023]本发明的有益效果是:本发明采用了黑暗温室-光照温室的培养条件，完善了诱导培养基和继代培养基及各个时期的培养温度、光照强度、光照时间，研宄出一整套适合红根野蚕豆组织培养方法的流程，大大的降低了成本，培育出大量成活率高的红根野蚕豆试管苗，从而满足市场对红根野蚕豆苗木的需求，是红根野蚕豆组织培养的领跑者，为中药材发展带来更大的社会效益和经济效益。
【附图说明】
[0024]图1组织培养红根野蚕豆的流程图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0026]实施例1
[0027]一种红根野蚕豆组织培养方法，包括如下步骤:
[0028](I)外植体的处理和保存:将从野外采摘回来的红根野蚕豆作为外植体